动物疫病采样技术规范

2020-12-29

四川畜牧兽医 2020年11期

关键词：无菌容器消毒

1 范围

本规范规定了动物疫病检验的样品采集、采样前准备、废弃物处置、采样记录、运送等技术。本规范适用于四川省行政区域内动物疫病病原学、病理组织学、血清学、免疫学等实验室检验所需样品的采集。

2 规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T 16569-1996 畜禽产品消毒规范

GB/T 18635-2002 动物防疫基本术语

GB/T 18935-2003 口蹄疫诊断技术

NY/T 541-2002 动物疫病实验室检验采样方法

病死及病害动物无害化处理技术规范（农医发〔2017〕25号）

《中华人民共和国动物防疫法》

《病原微生物实验室生物安全管理条例》

《兽医实验室生物安全技术管理规范》

《高致病性动物病原微生物菌（毒）种或者样本运输包装规范》

3 术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3.1 样品取自动物或环境，拟通过检验反映动物个体、群体或环境有关状况的材料或物品。

3.2 病料来自患病或可疑患病动物的被（待）检材料。

3.3 采集通过一定的方法，按照特定的程序和要求，对样品进行收集、处理及整理的过程。

4 样品采集原则

4.1 先排除后采样凡发现急性死亡的动物，怀疑患有炭疽时，不得解剖。应先按NY/T 561-2015 中2.2 的规定采集血样，进行血液抹片镜检。确定不是炭疽后，方可解剖采样。

4.2 采集数量进行流行病学调查、抗体监测、动物群体健康评估或环境卫生检测时，样品数量应满足生物统计学的要求。

4.3 采样时限健康动物和濒临死亡动物根据样品采集需求及时采样；病死后的动物要立即采集样品，夏季不超过6 h，冬季不超过24 h。

4.4 无菌操作采集过程中应该注意无菌操作，刀、剪、镊子、器皿、注射器、针头等采样用具应事先严格灭菌，每种样品应单独采集。

4.5 尽量减少应激和损害活体动物采样时，应避免过度刺激或损害动物；也应避免对采样者的危害。

4.6 生物安全防护采样人员应加强个人防护，严格遵守生物安全操作的相关规定，严防人兽共患病感染；同时应做好环境消毒及动物或组织的无害化处理，避免污染环境，防止疫病传播。

5 采样前准备

5.1 采样人员采样人员应熟悉动物防疫的有关法律法规，具有一定的专业技术知识，熟练掌握采样工作程序和采样操作技术。采样前，应做好个人安全防护（穿戴手套、口罩、一次性防护服、鞋套等，遇到高风险传染病时戴护目镜或面罩），严格遵守生物安全操作的相关规定，避免对样品、环境的污染和对采样人员的伤害。

5.2 采样工具和器皿

5.2.1 应根据采集样品种类和数量的需要，选择不同的采样工具、器械及容器等，并进行适量包装。

5.2.2 金属器械可采用103 kPa 高压30 min，或160 ℃干烤2 h 灭菌、煮沸消毒30 min。临用时75%酒精拭擦，或用时进行火焰消毒。

5.2.3 器皿（玻制、陶制等）经高压、干热灭菌（同5.2.2），或经0.5%～1%碳酸氢钠水中煮沸10～15 min，再用无菌纱布擦干，无菌保存备用。

5.3 保存液应根据所采样品的种类和要求，准备不同类型并分装成适量的保存液，如PBS 缓冲液、30%甘油磷酸盐缓冲液、灭菌肉汤和运输培养基等。

5.4 采集样品种类

5.4.1 根据不同的检验要求进行样品采集，采取包括相应的组织器官、内容物、分泌物、排泄物或其他材料。

5.4.2 结合流行病学特点、临床症状和剖检变化，根据疫病的特点和需采取的检查方法，采集相关部位的病料。口蹄疫监测，可取水疱皮和水疱液检查，屠宰后采取淋巴结、脊髓或肌肉等；结核病监测可采取痰、乳、精液、子宫分泌物、尿和粪便等，死畜可采取淋巴结或其他组织；禽流感监测，可取咽拭子或泄殖腔拭子和血清样品。

5.4.3 无法估计病因时，可对组织器官、分泌物和排泄物进行系统全面的采集。

6 样品采集

6.1 血样

6.1.1 采血部位根据动物种类确定采血部位。牛、马、羊常采用颈静脉、尾静脉；猪常采用耳静脉、前腔静脉、尾静脉；毛皮动物小量采血穿刺耳尖或廓外静脉，多量采血在颈静脉采集，或用划破趾垫0.5 cm 深度、剪断尾尖部采血。啮齿类动物尾尖采血，或眼窝血管丛采血。兔耳背静脉、颈静脉或心脏采血。禽类翅静脉采血，或心脏采血，鸭采用跖内侧静脉采血。

6.1.2 血液样品的处理

6.1.2.1 全血样品容器中需加入0.1%肝素钠或阿氏液或枸橼酸钠（3.8%～4%的枸橼酸钠0.1 mL，可抗1 mL 血液）或乙二胺四乙酸（EDTA，PCR 检测血样的首选抗凝剂）等抗凝剂，采血后充分混匀。

6.1.2.2 脱纤血应将血液置入装有玻璃珠的容器内，反复振荡，待纤维蛋白凝固后，即可制成脱纤血样品，经密封后贴上标签，以冷藏状态立即送实验室。

6.1.2.3 血清将血样在室温下倾斜30°静止2～4 h，待血液凝固，有血清析出时，无菌剥离血凝块，然后置4 ℃冰箱过夜，待大部分血清析出后，分离血清，必要时可低速离心（1 000 g，10～15 min）分离血清，若需长时间保存，则将血清置-20 ℃以下保存，但要尽量减少反复冻融。

6.1.2.4 血浆应在样品容器内先加入抗凝剂（见6.1.2.1），血液采集完后，将血液与抗凝剂充分混合，然后静止，待红细胞自然下沉或离心沉淀后，轻轻吸取上层血浆。

6.2 组织样品

6.2.1 病原学检测样品用常规解剖器械剥离动物的皮肤，体腔用消毒器械剥开，所需样品按无菌操作方法采集。做病原分离用，如进行细菌、病毒、原虫等病原分离所用的组织块的采集，均用新消毒的器械切取所需器官的组织块，每个组织单独放在已消毒处理的容器中，注明采样动物、日期、组织名称，防止相互污染。

6.2.2 组织病理学检查样品采集包括病灶及临近正常组织的组织块，立即放入不低于10倍于组织块的10%的中性福尔马林溶液中固定，固定时间一般为16～24 h。组织厚度不超过0.5 cm，长宽不超过1.5 cm×1.5 cm大小（检查狂犬病则需要较大组织块）。组织块切忌挤压、刮摸和用水洗。如做冰冻切片，则将组织放在0～4 ℃容器中，送往实验室检验。

6.2.3 皮肤样品有水泡或皮肤病变疾病的动物，应直接从病变部位采集。病变皮肤的碎屑、未破裂水泡液、水泡皮作为样品。

6.2.4 肠内容物和粪样肠道只需选择病变最明显的部分，将其中的内容物弃去，用生理盐水轻轻冲洗；无菌截取肠道组织，置于灭菌容器或塑料袋中送检。取肠道内容物时，应烧烙肠壁表面，用吸管扎穿肠壁，从肠腔中吸取内容物，将肠内容物放在盛有灭菌的30%甘油生理盐水缓冲液中保存送检。或将带有内容物的肠管两端结扎，从两端剪断送检。

取粪便时应将消毒拭子插入动物肛门或泄殖腔中，旋转2～3 圈刮取直肠粘液或粪便，放入装有30%甘油磷酸盐缓冲液或者半固体培养基中送检，若检查消化系统寄生虫，则需采取适量新鲜粪便。

6.2.5 体液样品

6.2.5.1 乳汁、精液及尿液用消毒水清洗乳头周边及乳头，并把乳房附近的毛刷湿，弃去3～4把奶液后进行采集，采集的奶液装于无菌试管中。精液样品易用假阴道挤压阴茎或人工刺激的方法采集。所采样品应包括“富精”部分，盛装于无菌试管中，避免防腐剂污染。在动物排尿时，用洁净的容器直接接取中段尿液，也可使用自封袋，固定在雌畜外阴部或雄畜的阴茎下接取尿液，采集尿液应早晨进行。

6.2.5.2 子宫阴道内分泌物或外生殖器包皮内分泌物的采集将消毒好的特制吸管插入子宫颈口或阴道内，向内注射少量营养液或生理盐水，用吸球反复抽吸几次后吸出液体，注入培养液中。用软胶管插入公畜的包皮内，向内注射少量的营养液或生理盐水，多次揉搓，使液体充分冲洗包皮内壁，收集冲洗液注入无菌容器中。

6.2.5.3 胃液及呼吸道分泌物胃液可用多孔的胃管抽取，将胃管送入胃内，其外端接在吸引器的负压瓶上，加负压后，胃液即可自动流出。反刍动物在反刍时，当食团从食道逆入口腔时，立即开口拉住舌头，伸入口腔即可取出少量的瘤胃内容物。呼吸道可用灭菌棉拭子采集鼻腔、咽喉或气管内的分泌物，然后将拭子浸入保存液中，密封低温保存。常用的保存液有pH 7.2～pH 7.4 的灭菌肉汤或磷酸盐缓冲液盐水。如准备将待检样本接种组织培养，则保存于含0.5%乳蛋白水解物的汉克氏液中，一般每只拭子需保存液5 mL。

6.2.5.4 脑、脊髓液颈椎穿刺法：穿刺点为环枢孔，将动物实施站立或横卧保定，使其头部向前下方屈曲，术部经剪毛消毒后，穿刺针与皮肤面呈垂直缓慢刺入，将针体刺入蛛网膜下腔，立即拔出针芯，脑脊液自动流出或点滴状流出，盛入消毒容器中。大型动物颈部穿刺一次采集量为35～70 mL。

腰椎穿刺法：穿刺部位为腰荐孔，将动物站立保定，术部经剪毛消毒后，用专用的穿刺针刺入，当刺入蛛网膜下腔时，即有脊髓液滴状滴出或用消毒注射器抽取，装入消毒容器中。大型动物腰椎穿刺一次采集量为15～30 mL。

6.2.5.5 其他液体采集胆汁、脓、黏液和关节液等样品时，用烫烙法消毒采集部位，用灭菌吸管、毛细吸管或注射器经烫烙部位插入，吸取内部液体病料注入灭菌的试管中，塞好棉塞送检。也可用接种环经消毒后的部位插入，提取病料直接接种到培养基或涂布到玻片上。

6.2.6 胚胎及胎儿选取无腐败的胚胎、胎儿或胎儿的实质器官，装入适宜容器内立即送检。如果在24 h 内不能将样品送达实验室，应冷冻运送。

6.2.7 脑、脊髓将采集的脑、脊髓浸入30%甘油生理盐水等保存液中送检，或根据要求送检。

6.3 其他

6.3.1 对于重大动物疫病如新城疫、口蹄疫、禽流感、猪瘟、高致病性蓝耳病的样品采集按照国家相关标准执行。

6.3.2 监测环境卫生或调查疾病，可从遗弃物、通风管、下水道、孵化场或屠宰场采集有代表性的样品。