海带发酵降解的复合菌种筛选及海藻寡糖产物的检测

陈 营，孙业梅，杨丹丹，郭 琳

(烟台大学生命科学学院 山东烟台 264005)

海带(Laminariajaponica)又名昆布，是生长于海洋中的大型褐藻，归属于光能自养型微生物[1]，是我国历史最悠久的食用及药用藻类之一。我国的褐藻资源丰富，海带在我国北部及东南沿海地区均有大量养殖，是养殖规模最大的重要经济藻类，具有独特的工业和食用价值。海带常年生长在低温的环境中，生长速度快、适应能力强，藻体中含有大量陆生生物不具有的营养物质和生物活性成分[2]，作为植物生物刺激素在农业中有着广阔的开发和应用前景[3]。

以海带为主要原料制备海藻肥料，通常采用化学、物理和生物的方法提取海带的有效成分，其中的标志性物质是海藻酸。海藻酸是一种酸性大分子的多糖物质，占藻体干质量的22%～44%[4]。当海藻酸以高聚合度的大分子状态存在时，黏度大、吸收利用差等特性限制了其应用的范围[5]。同时，海藻酸构成了海带、马尾藻、巨藻等褐藻细胞壁的主要成分，也是藻体细胞间骨架的基质[6]。经过提取处理后，海带藻体结构被破坏，释放出细胞内的全部营养物质。而海藻酸或其黏度降低，或变成小分子海藻寡糖，水溶性和吸收度增大，呈现更多的生物活性作用，如植物生长的刺激作用和植物抗病力的诱导效应[2]。在海藻的各种提取方法中，生物法因其条件温和可控、特异性强、绿色无污染，日益受到人们的重视。因此，筛选海带降解菌或降解酶，最大程度地保证海藻有效成分的完整性，对海藻提取物的应用是至关重要的[3]。目前，大部分的海带降解菌或降解酶都源于海洋细菌，如弧菌(Vibrio)[5，7-9]、交替假单胞菌(Pseudoalteromonas)[10-11]、交替单胞菌(Alteromonas)[12]、芽孢杆菌(Bacillus)[13]、Shewanella[14]、Tamlana[15]。生物法的优势除了反应温和、无营养损失外，其产物也独具特殊性。海藻酸经过微生物酶的裂解后，其产物海藻寡糖的非还原端C4与C5间会产生一个双键，在波长235 nm处有最大吸收峰，通过比色法可以测定海藻寡糖的含量[16]。由此制备的非饱和寡糖具有生物学活性，而由其他方法制备的饱和寡糖则不具有[10]。

本文从实验室保存的海带降解菌群中分离纯化出相关的海带降解菌，通过分析菌种之间的相互作用，检测发酵产物中海藻寡糖的组成和含量，筛选并重新组成复合微生物菌种，用于海带发酵降解制备海藻寡糖的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

样品，购于烟台本地市场的干海带；菌种，本实验室保存于海带发酵液中的海带降解菌群；培养基，富集培养基等参考文献[17]。

1.2 试验设备

VD-850型桌上式洁净工作台，苏州净化设备有限公司；TG16-W型微量高速离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；LDZX-40BⅠ型立式全自动电热压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；隔水式电热恒温培养箱，上海市跃进医疗器械一厂；HZQ-F160型振荡培养箱，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；UV-1900型紫外-可见分光光度计，翔艺仪器(上海)有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 海带降解菌群的活化及分离纯化

取保存的海带发酵液，按5%(体积分数，下同)接种至富集培养基中，在37 ℃、160 r/min下培养至海带片90%以上分解。继续传代培养2次，直至海带分解效果稳定。取海带降解液进行适当稀释后，涂布牛肉膏蛋白胨平板。待平板上有菌落生长后，选取形态不同的菌落反复几次划线培养，纯化后的菌种留待备用。

1.3.2 微生物菌种之间的相互作用分析

(1)交叉划线法[18]。 将纯化的菌种两两之间在牛肉膏蛋白胨平板表面交叉划线，培养后在两种菌交叉的地方观察细菌生长情况。交叉处细菌的生长如果优于单一划线处的细菌，说明两种菌之间有相互促进的作用；反之，说明细菌之间没有相互促进作用。

(2)滤纸片法[19]。先选择一种菌液涂布于平板表面，然后将灭菌的滤纸片浸入其他的菌悬液中，待滤纸片微干后贴于培养基表面，培养后观察滤纸片周围细菌的生长情况。若滤纸片周围的细菌生长得更好，说明两细菌之间有相互促进作用；反之，则无作用。

1.3.3 海带的混合发酵与海藻寡糖含量的测定

取纯化的菌种，以等比例混合接种至富集培养基中，在37 ℃、160 r/min下培养4 d。以各自单一菌种接种富集培养基和空白培养基作对照，每组均为两个平行。发酵结束后，取各自海带发酵液以4 000 r/min离心10 min，再取上清液稀释40～50倍，在波长235 nm下测定吸光度，即可比较各发酵液中海藻寡糖含量的差异，从而确定海带分解的效果。

1.3.4 海带发酵复合菌种的比例分析

从上述海带的混合发酵中，选取海带分解达到90%以上和海藻寡糖含量较高的组合，采用平板培养法对最终发酵液中的菌种计数，确定混合发酵的接种比例。

1.3.5 复合菌种发酵产物的薄层层析

薄层层析所用展开剂为正丁醇∶乙酸乙酯∶异丙醇∶冰乙酸∶水(2∶6∶6∶4∶1)。将点样的硅胶板放于盛有展开剂的层析缸中，在50 ℃下待样品扩散至距硅胶板顶端约1 cm处，取出在70 ℃烘烤30 min。 烘干后，均匀喷体积分数为30%的硫酸溶液进行显色，并在110 ℃烘烤10 min后观察。以质量分数为1%的葡萄糖、蔗糖溶液作为对照。

1.3.6 混合发酵复合菌种的鉴定

试验采用煮沸法提取细菌基因组，并进行16S rDNA测序鉴定。PCR扩增引物为细菌通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。

2 结果与分析

2.1 海带降解菌的分离和纯化

对实验室保存的海带发酵液进行连续传代培养，在37 ℃、160 r/min条件下培养3～4 d，海带分解达到90%以上。这是一个海带降解菌群的富集培养液，经过近3年的保存，其混合菌群的种类逐渐变少，但降解海带的效果仍然很好。经平板涂布分离及划线纯化后，共获得3种不同菌落形态的菌株，分别命名为Lj1、Lj2和Lj3。

2.2 微生物菌种之间的相互作用

在交叉划线试验中，Lj1和Lj2交叉划线处的细菌生长优于单菌生长，两菌株之间可能存在相互促进作用；Lj2和Lj3交叉划线处的细菌生长较差，不如单菌生长，两菌株之间可能有抑制作用；Lj1和Lj3之间的关系不是很明显。

在交叉划线试验的基础上进行滤纸片法分析，先将Lj2涂布于平板上，再将浸有Lj1和Lj3 的滤纸片贴在平板表面。结果表明：Lj2的代谢产物促进了Lj1的生长，进一步确定了两者之间的协同作用；Lj2和Lj3之间作用不明显或没有促进作用。

2.3 海带发酵复合菌种的筛选

经过检测混合发酵液中海藻寡糖的含量，以Lj1+Lj2组合的含量最高，稀释50倍后的平均吸光度为0.784，其次为Lj1+Lj3和Lj2+Lj3组合。3种菌株的组合和单一菌株发酵液中，海藻寡糖含量均较低，与空白对照相当，结果见图1。

图1 海带发酵液中海藻寡糖含量测定结果

结合海带的分解效果，也是Lj1+Lj2组合中的海带分解最好，在3～4 d可使质量分数30%的湿海带分解率达90%以上。因此，选用Lj1+Lj2组合作为海带发酵降解的复合菌种。

2.4 海带发酵的复合菌种鉴定、菌种比例及产物组成

利用Lj1+Lj2复合菌种发酵海带，起始接种时两者是等比例混合。由于两者之间的偏利共生关系，即Lj2促进Lj1生长的现象，经过3～4 d的混合培养，在发酵结束后经平板计数，最终Lj1和Lj2的活菌数比例变为3∶2。这个比例是两者在海带中的最佳比例，也应该是发酵起始接种的合适比例。

复合菌种分别经细菌16S rDNA测序鉴定，Lj1为印度斯塔普氏菌(Stappiaindica)，Lj2为陶氏假单胞菌(Pseudomonastaeanensis)。斯塔普氏菌是一种不常见的细菌，而假单胞菌在自然界中广泛存在，对各种碳源物质的利用种类最多、能力最强。

通过薄层层析对海带发酵液中海藻寡糖种类进行分析时发现，海带发酵液的层析斑点完整、不拖尾，在蔗糖附近略靠下的位置。由此可以推测海带发酵液中的海藻寡糖大致为单一组分的三糖，见图2。

图2 海带发酵液的薄层层析分析

3 结语

海带的细胞壁组成十分复杂，含有海藻酸和其他的多糖成分，这些可以成为微生物生长繁殖的营养物质和能源[20]。只有能利用这些物质的微生物才能将其降解成小分子，破坏细胞壁的保护结构，释放出细胞内的营养物质。因此，利用不同菌种的代谢酶系，可以更好地协同作用，更快、更有效地降解海带。从实验室保存的海带降解菌群中共获得3株细菌，通过分析两种不同方法的菌种之间的相互作用，得出Stappiaindica和Pseudomonastaeanensis之间有协同促进作用；对不同菌种组合的海带发酵产物进行235 nm光吸收检测，也表明这两个菌种组合产生的海藻寡糖含量最高，分解海带的效果最好，而任一单菌种或其他组合效果都不好。所以，后续的研究选用Stappiaindica和Pseudomonastaeanensis作为海带发酵降解的复合菌种。Sun等[21]在海带的表面分离到一株细菌Bordetellasp. HZ20，这株菌没有分解海带的能力，但可能具有分解几丁质和聚羟基脂肪酸酯(PHA)酶系的能力，与其他菌共同参与碳、氮、磷、硫的代谢，这或许是该菌在海带表面生态系统中存在的意义。

试验分离的假单胞菌是自然界中利用碳源物质能力最强的细菌，如海带含有的各种多糖。在与斯塔普氏菌混合发酵海带的过程中，假单胞菌产生的代谢产物促进Stappiaindica的生长，两者共同作用使海带降解。Stappiaindica在这个过程中可能具有独特针对海带中某种成分的利用和分解能力，有待进一步验证。此复合菌种在4 d之内可使质量分数30%的湿海带几乎全分解，而且产物经薄层层析推测为单一的三糖。柏超[15]从海带降解菌群中分离到两株高效降解菌株，其中假单胞菌具有淀粉酶、果胶酶、纤维素酶和海藻酸裂解酶活性，Tamlana具有海藻酸裂解酶活性。利用这两株菌的重新组合，只需要5 d就可以把培养基中质量分数20%的海带块完全降解。姚艳艳等[8]利用弧菌 YY7 菌株发酵液降解海带粉，酶解6 h的降解率可达 65% 以上。汤海青[10]通过薄层层析推测由海藻酸裂解酶制备的产物为寡糖混合液，各寡糖的聚合度为2～9，其中以聚合度2～6的寡糖为主，酶解的终产物为二糖和三糖。可见，从不同环境分离的菌株，降解海带的能力不同。菌种的组合不同、反应条件不同，对海带的降解效率和产物组成是有差异的。为实现海带发酵降解的工业化生产，后续还将进行菌种的稳定性和发酵工艺优化的研究。同时，亟待建立检测海藻寡糖的方法并制定相应的标准。