香龙血树嵌合体离体再生培养体系研究

2020-12-28夏胜蔡红菊施兰

安徽农学通报 2020年22期

夏胜蔡红菊施兰

摘要：为建立香龙血树嵌合体组织培养快速繁殖体系，以金边香龙血树和金心香龙血树的叶片、茎段为外植体，研究愈伤组织的诱导培养及继代增殖培养情况。结果表明：2种材料叶片均未诱导出愈伤组织;金边香龙血树茎段愈伤组织诱导的最佳培养基为：MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.5mg/L 2，4-D+0.5g/L活性炭;金心香龙血树茎段愈伤组织诱导的最佳培养基均为：MS+5.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.5g/L活性炭;金边及金心香龙血树正常愈伤组织诱导不定芽分化最佳培养基为：MS+3.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.5g/L活性炭;金边香龙血树嵌合体愈伤组织诱导不定芽分化最佳培养基为：MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.5g/L活性炭;金边香龙血树绿色不定芽增殖最佳培养基为：MS+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+0.5g/L活性炭;金边香龙血树嵌合体不定芽和金心香龙血树绿色不定芽增殖最佳培养基为：MS+3.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.5g/L活性炭。

关键词：香龙血树;嵌合体;离体培养

中图分类号 S687文献标识码 A文章编号 1007-7731（2020）22-0029-05

Abstract：Using the leaves and stems of as the explants，callus induction culture and the subculture proliferation culture were studied on Dracaena fragrans cv. lindenii and Dracaena fragrans cv. massangeana with a view to establishing a tissue culture rapid propagation system of Dracaena fragrans chimera. The results showed that the leaves of both materials were not able to induce callus. MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.5mg/ L2，4-D+0.5g/L activated carbon was the best medium for inducing the callus of the stem section of Dracaena fragrans cv. Lindenii，MS+5.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.5g/L activated carbon was the best medium for callus induction of the stem section of Dracaena fragrans cv. Massangeana，MS+3.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.5g/L activated carbon was the best medium for inducing adventitious bud differentiation of normal callus of Dracaena fragrans cv. lindenii and Dracaena fragrans cv. Massangeana，MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.5g/L activated carbon was the optimal medium for chimera callus of Dracaena fragrans cv. lindenii inducing differentiation of adventitious buds，MS+3.0mg/ L 6-BA+0.1mg/L NAA+0.5g/L activated carbon was the optimal medium for adventitious bud proliferation of Dracaena fragrans cv. Lindenii，MS+3.0mg/L 6-BA+0.5mg /LNAA+0.5g/L activated carbon was the best medium for the proliferation of adventitious buds of Dracaena fragrans cv. lindenii chimera and green adventitious buds of Dracaena fragrans cv. massangeana.

Key words：Dracaena fragrans;Chimera;In vitro culture

香龙血树（Dracaena fragrans）是百合科龙血树属常绿乔木植物，别名也门铁、大龙血树、香千年木、巴西木、巴西铁树、山德氏龙血树[1]，呈灌木或乔木状，茎较粗，叶片宽大，丛生于茎顶，穗状花序，花小，带有浓烈的香气，是良好的香味树种，极具观赏价值[2]。

香龙血树被广泛用作园林园艺中流行的观叶植物，其主要繁殖方法包括扦插繁殖、高空压条繁殖、种子繁殖，最快的繁殖方法是组织培养，利用该技术可以生产无毒的幼苗，获得大规模育苗，有效地解决市场种苗短缺的问题。Vinterhalte最早采用组织培养技术成功诱导出香龙血树的愈伤组织并培育成苗[2]。漆丽萍等[3]、何业华等[4]、陈兴华等[5]、陈丽文等[6]采用MS作为基本培养基，培养基中添加IAA、6-BA、KT、Ad、NAA、IBA等作為生长调节剂，以香龙血树的茎段、腋芽、顶芽、叶片为接种材料，通过研究都已经取得了成功。

嵌合体植株极具观赏价值，嵌合体会使植株叶片出现2种或2种以上的不同颜色，主要是通过不同遗传类型的植物组织细胞保留在顶端细胞系统中转化成为分生组织后分化出叶原基而形成，能够培育出多种稀奇的新品种植物[7]。嵌合体植物因其色彩绚丽、奇异新颖，已被很多国家广泛研究和利用，在观赏植物市场的开发和利用中发挥着重要作用。我国植物资源丰富，种类繁多，观赏植物的开发和生产具有十分广阔的前景，加强植物嵌合体的研究，促进其开发利用，具有十分重大的意义和价值[8]。常见的香龙血树嵌合体栽培品种有金边香龙血树、金心香龙血树、黄边香龙血树、银边香龙血树[9]。

虽然植物嵌合体极具观赏价值，但由于植物嵌合体的结构特征很不稳定，嵌合体性状难以保持，在组织培养过程中经常会发生变异[10]。何业华等[4]、易清等[11]、吕秀立等[12]通过组织培养对植物嵌合体性状稳定性、变异规律及调控进行了研究。研究表明，在不定芽分化诱导和增殖过程中，选择能抑制愈伤组织的形成和分化，以及促进腋芽分化和萌发的技术措施，能增强组织培养过程中嵌合体性状的稳定性[4]。王燕等[10]通过定芽途径即从顶芽诱导丛生芽增殖和从去除顶芽的茎段诱导腋芽增殖，结果显示丛生芽增殖方式增殖率高于腋芽增殖率，但丛生芽增殖方式的变异率更高，因此认为腋芽增殖繁殖是保持嵌合体特性的离体快繁的最佳方式。激素高低也会影响嵌合体性状的稳定性，激素浓度越高，嵌合体的变异率越低，选择合适的激素浓度也可以保持嵌合体性状的稳定性[12]。

1 材料与方法

1.1 材料金心香龙血树的叶片和茎段材料，来源于普洱学院小山坡发现的金心香龙血树植株;金边香龙血树的叶片和茎段材料，来源于喜庆园林责任有限公司取材进行香龙血树组织培养研究培育出的金边香龙血树变异植株[3];金边及金心香龙血树不定芽增殖和愈伤组织诱导不定芽的材料，来源于前两者外植体经过组织培养诱导产生。

1.2 方法

1.2.1 外植体预处理分别截取金心香龙血树和金边香龙血树的叶片和茎段，把叶片表面清洗干净，然后将叶片带有黄色条纹状的部分剪成长3cm、宽2cm左右的方形，置于自来水下冲洗30min;洗净茎段表面肉眼可见的脏物，重点清洗茎基部，然后置于自来水下冲洗30min。

1.2.2 外植体消毒与灭菌叶片消毒灭菌：用酒精浸泡15s，然后在0.1%的升汞溶液下消毒灭菌9min，边消毒边震荡，最后用灭菌过的蒸馏水冲洗4次。

茎段消毒灭菌：将金边香龙血树和金心香龙血树的茎段，先用75%酒精浸泡20 s，再用0.1%的升汞溶液消毒灭菌9 min，最后用蒸馏水冲洗4次。

1.2.3 培養基的配方与外植体接种培养培养基的配方为：MS+6-BA+NAA+2，4-D+IAA+0.5g/L活性炭，6-BA设置1、2、3、5mg/L 4个浓度，NAA设置0.1、0.2、0.5mg/L 3个浓度，2，4-D设置0.5mg/L 1个浓度，IAA设置0.2mg/L 1个浓度，7种培养基配方见表1。其中1～4号为初代愈伤组织诱导培养基;5～7号为继代增殖培养基。

叶片诱导培养：将消毒9min的金边和金心香龙血树的叶片切成0.5cm×1.0cm大小，然后分别接种到1、2、3、4共4种培养基中，每种培养基接种10瓶，每瓶3个叶片，观察4种培养基中叶片愈伤组织的诱导效果。

不定芽增殖和愈伤组织诱导不定芽培养：选取金边及金心香龙血树组织培养产生的愈伤组织和不定芽接种于5、6、7三种培养基中，每种培养基接种10瓶，每瓶接种1个培养材料，观察愈伤组织和不定芽的培养情况。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对香龙血树叶片愈伤组织的诱导效果金心香龙血树和金边香龙血树的叶片在1、2、3、4号培养基上均没有产生愈伤组织（表2）。

2.2 不同培养基对香龙血树茎段愈伤组织的诱导效果由表3可知，金边香龙血树茎段愈伤组织在3号培养基上的诱导率最高，为30%;其次是2号培养基的诱导率最高，为25%;1号和4号培养基诱导率最低，仅为10%。因此，金边香龙血树茎段愈伤组织诱导的最佳培养基为3号培养基。金心香龙血树茎段在2号培养基上的诱导率最高，为40%;其次是3号和1号培养基，诱导率分别为30%和25%;4号培养基的诱导率最低，仅为10%。因此，金心香龙血树茎段愈伤组织诱导的最佳培养基为2号培养基。诱导产生的愈伤组织中，诱导愈伤组织上开始分化出不定芽。

2.3 金边及金心香龙血树愈伤组织和不定芽继代培养通过茎段诱导培养实验获得了金边和金心香龙血树的愈伤组织和不定芽，其中发现金边香龙血树茎段诱导出的愈伤组织中，有正常愈伤组织（图1d）和嵌合愈伤组织（仅有1个，图1e）之分;在正常愈伤组织中诱导出绿色不定芽（图1a），在嵌合愈伤组织上诱导出嵌合不定芽（图1b）。金心香龙血树茎段诱导出的愈伤组织均为正常愈伤组织（图1f），分化出的均为绿色不定芽（图1c）。

将已经获得金边和进行香龙血树愈伤组织和不定芽材料进行增殖，转接至5～7号培养基中进行继代培养。由表4可以看出：金边龙血树正常愈伤组织在5号培养基中愈伤组织诱导形成芽最数最多为3.20±1.09;金边香龙血树嵌合体愈伤组织在7号培养基中愈伤组织诱导形成芽数最少为0.70±0.40;数据表明：5号培养基即MS+3.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.5g/L活性炭可以诱导愈伤组织获得更多不定芽。

由表5可以看出：金边龙血树绿色不定芽在7号培养基中芽增殖倍数最高为4.60±1.18个;金边龙血树嵌合体不定芽在5号培养基中芽增殖倍数最高为2.60±0.65个。

图2是在此次继代实验中得到的金边及金心香龙血树绿色不定芽和嵌合体不定芽。如图2a所示，是通过金边不定芽增殖所得绿色不定芽，图2b是由金边嵌合不定芽增殖所得金边叶色嵌合体不定芽，叶片边缘为金黄色，保持了嵌合体性状，图2c是由金心不定芽增殖所得绿色不定芽（可能由于营养缺乏，已经开始黄化），图2d由金边正常愈伤组织所得金边正常绿色不定芽，图2e由金边嵌合体愈伤组织所得金边叶色嵌合体不定芽，叶片边缘为金黄色，保持了嵌合体性状，图2f是由金心正常愈伤组织所得正常绿色不定芽（可能由于营养缺乏，已经开始黄化）。

经过愈伤组织和不定芽继代增殖后，有的金边嵌合体愈伤后期死亡，有的嵌合愈伤分化出的不定芽仍为绿色，有的不定芽叶腋处分化的不定芽为绿色等原因，经统计，通过继代增殖培养，获得了22个保持金边嵌合性状的不定芽。

3 讨论

耿开友等[13]认为植物的金心或金边是一种嵌合体的后生突变现象，其金黄色物质仅存在于芽端生长点的细胞和茎的形成层之中，想要通过组织培养繁殖金边虎尾兰，必须以顶芽或侧芽为外植体，利用丛生芽快繁途经才能保持金边性状。因此，基于嵌合体特殊性考虑，应首选用顶芽或侧芽做为外植体。本研究的金边香龙血树材料来自组织培养中的变异株[3]，材料仅有一棵。金香龙血树来源于普洱学院小山坡，仅有5株。刘和平等[14]用也门铁（香龙血树）叶片作为外植体进行组织培养获得了愈伤组织，最佳培养基配方是MS+0.5mg/L2，4-D+0.5mg/L NAA+1.0mg/L BA，诱导率达到44.4%。由于本研究的3號培养基和刘和平等[14]的最佳培养基配方一致，因此先以金边和金心香龙血树叶片作为外植体，但均未诱导出愈伤组织。而采用茎段为外植体进行愈伤组织诱导，2种材料均诱导产生了愈伤组织。金心香龙血树茎段产生的愈伤组织全部正常，金边香龙血树愈伤组织中仅有1个愈伤组织上分化出了嵌合体不定芽，可能是位于最靠近顶端分生组织的部位。

本研究通过初代培养和继代增殖培养，获得了22个保持金边嵌合性状的不定芽，为后续金边嵌合性状稳定性研究奠定基础。从本研究结果来看，茎段不适宜作为外植体开展组织培养研究来保持嵌合性状。在嵌合体不定芽资源充足情况下，应选用顶芽诱导丛生芽和茎段腋芽增殖途径进行增殖，在适宜培养基诱导下，可对嵌合体进行进一步组培扩繁研究。

参考文献

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[3]漆丽萍，马剑，李剑美，等.香龙血树组织培养研究[J].安徽农业科学.2018，（34）：71-74.

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