月季分类方法及其研究进展

钟光跃 黄平 杨敏 欧军 钟守生 李华雄

摘   要   月季品种繁多，是我国的传统名花，其与原种蔷薇杂交频繁、芽变频率较高，特别是现代技术让月季与不同种属植物远缘杂交获得成功，使月季的形态特征发生了巨大的变化。科学分类对月季资源收集、品种评价、育种、推广、利用具有指导作用。月季资源分类鉴定的方法很多，有园艺分类法、数量分类法、花粉形态分类法、同工酶分类法、染色体核型分类法、分子标记分类法等。单一方法的分类结果都不理想，只有多种分类法结合使用，才能使分类结果准确、可靠。简述月季分类研究历史及进展，分析各种分类方法的优缺点，提出以形态分类为主、分子标记为辅的月季分类方法是最合理的方法，并建议将月季分类方法统一、过程规范化，制定一套月季分类规程，建立一部严格的月季分类标准。

关键词   月季;分类;历史;形态分类;数量分类;分子标记

中图分类号：S685.12   文献标志码：C    DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.31.019

月季（Rosa chinensis Jacq.）属蔷薇科蔷薇属灌木植物，具有色彩绚丽、花型多样、观赏期长等优点，深受人们喜爱，是我国的传统名花[1]。据统计，全世界现代月季品种有2万多个，我国就有1 000多个[2]。月季具有芽变频率高、与原种蔷薇杂交频繁的特点，特别是近现代育种学家通过现代育种手段让月季与不同种属植物远缘杂交获得成功，使得月季的形态特征发生了巨大的变化。月季品种分类是研究月季的基础，对资源收集、品种评价、育种、利用、推广具有指导作用。本文简述了月季分类研究的历史和进展，介绍了月季分类方法及其优缺点，提出了以形态分类为主、分子标记分类为辅的月季分类法是最合理的方法，并建议将月季分类方法统一，过程标准化。

1 月季资源分类历史

1.1 基于遗传历史的分类

Wylie A.P.于1954年、1955年分别对月季的历史进行了系统研究，将1800年定为月季发展的分界时间，1800年以前的月季品种属于传统月季，此类月季包括欧洲的突厥蔷薇、法国蔷薇、百叶蔷薇、长春花、宝相花、月月红、四季花等，此类月季没有经过种间和属间杂交;1800年以后，中国月季传入西方，与欧洲蔷薇反复杂交形成观赏价值高且四季开花的月季新品种，俗称现代月季，包括杂交茶香月季和多花月季的各大类群[3]，从此开辟了现代月季的新篇章。1966年，美国月季协会定义1867年之前的蔷薇属品种群（包括变种）称为古老月季，1867年第一个杂交茶香月季出现以后培育的品种群为现代月季[4]，并将月季细分为37个小类，称ARS分类系统。而后，英国皇家月季协会对ARS分类系统进行简化，细分类群缩减到30个，称BARB分类法[5]。早期的遗传分类主要依靠形态观察，体现的是月季品系间的血缘关系和进化过程，是月季分类的第一阶层，但对于品系间、种属间和远缘杂交的新品种很难判断。

1.2 基于生活习性和外部特征的分类

1976年由英国皇家月季协会提出和修订，并于1979年在南非比勒陀利亚会议上获得批准的园艺分类法至今在沿用，其将月季分为6大类[6]。世界月季联合会按园艺分类法将月季分为野生蔷薇、古代月季和现代月季三大类，每一大类又按照生活习性、是否藤本、是否连续开花、花朵大小、花朵是否簇生进行细分，古代月季细分为13小类，而现代月季分为8小类[7]，称之为WFRS分类法。园艺分类法在很长一段时间作为月季权威分类法而被各国学者广泛采用。

1.3 基于现代科学的分类

随着月季育种技术的提高，种间甚至属间杂交新品种越来越多，经常会出现传统分类的中间类型，怎样划分新资源、新品种的归属问题日趋复杂。借助现代科学辅助分类，是近现代月季分类学研究的重点，也是热点。如基于数学统计方法的数量分类法，基于遗传学、细胞学、分子学发展的花粉形态分类法、同工酶分类法、分子标记分类法等。现代分类方法丰富了月季分类的内容，克服了传统分类法受环境变化而不准确的弱点，更客观地反映月季的属性。

2 月季分类方法

2.1 园艺分类法

园艺分类法是以月季进化过程中亲缘关系的远近、生活习性、观赏价值等综合评价而进行的分类。我国花卉协会沿用的分类法主要是WFRS分类法。对观赏植物来说，园艺性状是种以下分类的重要依据，它直观地反映植物的演化关系。

2.2 形态分类法

2.2.1 数量分类法

形态分类以其简单直观、快捷方便的特点最早为人们所认识和接受，是其他分类方法的基础[8]。数量分类学则将形态性状编码，进行数学方法分析，研究从定性升级到定量水平。数量分类方法可以综合分析多种生态性状，得出客观系统的分类结果。这种方法不仅能进行植物分类，还能测定种质间的亲缘关系，以及物种进化的效率等，已广泛应用在植物分类学中[9]。数量分类根据分析性状的多少，可采取不同的数学分析方法，对单一性状的评价，一般采用方差多重比较法，它操作过程简单、分析程式化、结论明晰，是目前最普遍的评价方法;对多个性状的评价最常用的是系统聚类法，其原理核心是将原始数据进行数字化处理，使不同性状量纲也能进行综合比较和分析，是比较理想的处理方法;另外还有基于数学模型的模糊数学法和灰色系统理论法、基于层次权重的层次分析法和百分制计分法等[10-11]。我国科学家在月季的数量分类领域做过很多研究，李宝忠选取36个月季形态性状，花部指标定为分类的第一级标准，枝部指标定为第二级标准，叶部综合指标定为第三级标准，然后将这些主要性状进行Q型聚类分析，结果24个月季品种可分为5大类型[2]。于守超以种源作为第一级分类标准，以花径、花色等为第二級分类标准，以枝色、枝刺作为第三级分类标准，初步建立了玫瑰品种的3系5类10型分类体系[12]。李东丽等对月季花朵颜色、株高等8个主要表型性状进行分析，将306份月季种质资源分为5组[13]。数据分析中，可以先对性状数据进行相关分析或R型聚类分析，剔除不稳定性状和与分类无关的性状，并从极显著相关的每一组中只选取一个易于观测的性状参与分析，避免分析数据的繁琐性和重复性，节约观察记录时间。不同性状在植物分类上的贡献是有主次之分的，对主要性状进行加权处理显得尤为重要。对性状进行分析，终究要将性状描述翻译成数学语言，即数字，怎样确定性状的编码数值最终会影响到分类结果。数量分类法因性状取舍、性状编码、分析方法的不同，分类结果也会不同，对同一性状观察的时期和时间不同，记录的结果也会不同。若要数量分类法具有可重复性和统一性，必须制定一套月季数量分类规程，规定取样性状，统一性状编码，规范操作流程，使试验操作标准化。对植物外部形态的观察记录受光照强度、日照时间、土壤、空气温度和湿度、病虫害等环境因素影响，仅针对植株形态性状进行数量分类比较片面，分类结果存在误差，数量分类法与传统分类法结合才更合理。

2.2.2 孢粉形态分类法

花粉的形态特征受植物基因型控制而不受外界条件影响，具有很强的遗传保守性，可以为植物系统分类学提供依据，是探讨植物起源、演化及亲缘关系的重要特征[3]。孢粉学是研究植物孢子和花粉形态的一门边缘学科，主要涉及花粉及孢子的壁，而对孢子和花粉的内含物研究很少。王文莉等对玫瑰花粉进行了电镜扫描，采用聚类分析将24个平阴玫瑰花粉分为玫瑰系和蔷薇系两大类，发现玫瑰外壁纹饰可作为玫瑰品种鉴别的依据[14]。贾元义通过花粉性状分析将20个品种分为5大类型，花粉性状中沟长、条脊宽、P/E、赤道轴长、纹饰类型、脊洼深度这几个指标比较重要，其次是极轴长、沟间距、条脊距、沟深等级、D/L、赤道面观、L/P和孔径等级，而孔频等级和极面观所占的系数很小[3]。孙佳等通过孢粉特征将微型月季分为外壁条纹和网眼密集型、外壁条纹密集网眼较少型、外壁条纹和网眼较少型[15-16]。一些学者对花粉的其他性状也开展了研究：石俊英等利用电泳技术对月季花粉进行分析[17];利用不同月季品种之间的花粉活力不同进行月季品种分类[18];杨攀等测定不同月季花粉生活力，并根据花粉萌发率将30个月季品种分成3个等级[19]。孢粉学分类结果和外部形態学分类结果基本相同，但也有细微差异，孢粉性状毕竟有限，只凭孢粉性状的差异还不能精确地将月季分类[20]。

2.3 染色体核型分类

蔷薇属核型分类主要是研究DNA的倍性和形态。蔷薇属染色体基数为x=7，且染色体倍性复杂多样，从二倍体到八倍体都有[21]，月季发现有二倍体、三倍体、四倍体、六倍体[22-24]。古代蔷薇都是2倍体，进而进化成多倍体。蔷薇中有5套染色体类型（A、B、C、D、E），每套中含有7对不同的染色体，不同染色体携带有不同的基因群，据此可以将月季按染色体类型进行分类。至今报道的月季染色体类型有1A、2A、1B、2B[22，25]，大部分品种的核型均由其中部和近中部着丝点染色体组成，少数种具近端着丝点染色体[26]。另外，月季染色体在核不对称系数、着丝粒指数、随体数目及位置、染色体相对长度组成等方面差异较大，说明在月季种质资源中存在着丰富的核型多样性，可以作为分类的依据[27]。遗传物质染色体的性状变异是新品种形成的基础，在现代月季育种过程中远缘杂交和反复回交使得月季染色体在数目、形态和结构上也发生了许多变化。月季核型性状虽然存在多样性，能追溯其来源及演化过程，但是核型性状与月季外形性状没有必然的联系，只能为月季的分类提供参考。

2.4 同工酶分类法

植物个体的性状是由基因决定的，而基因在植物生长发育过程中的表达需要通过器官或组织同工酶来完成。同工酶谱表现的是基因表达后的分子水平表型，其类型和含量的变化先于植物形态结构变化，是形态结构变化的前因[28]。同工酶谱可以直接反映对应基因的存在和表达与否，是一种十分有效的遗传标记方法。贾元义等通过电泳检测出了月季的8条过氧化物酶同工酶谱带，将18个月季品种分成5类，其分类结果与传统分类结果有一定的差别[29]。刘承源研究了27份月季资源的过氧化物酶同工酶谱带，发现不同月季种质间存在一定同源性，同时也有较大差异;通过聚类分析，将种质资源分为3大类[30]。同工酶是基因表达的直接产物，有很高的稳定性，然而植株器官中的同工酶类型及含量是随生长发育进程变化的[31]，又具有不稳定性，要拟定严格的取样标准和操作程序，才能获得准确的可重复的研究结果。

2.5 分子标记法

2.5.1 RFLP

Hubbard等采用限制性片段长度多态性（RFLP，Restriction Fragment Length Polymorphism） 技术鉴定了3个来源不同的月季品种[32]。Ballard等对22个月季栽培品种进行了RFLP分析，鉴定出其中20个月季品种[33]。Majapakse用RFLP技术进行了月季品种鉴别，并建立了分子数据库，为月季品种分类和专利保护提供了基础[34]。RFLP法DNA用量大，提取DNA费时费工，成本高，操作程序多，实验过程复杂，检测中需要放射性同位素，不利于实验操作人员的身体健康。目前，此项技术总体来说在国内应用得较少，究其原因是RFLP技术缺点太明显，而且我国分子标记研究起步较晚，RFLP已被更简便的分子标记技术所取代。

2.5.2 RAPD

随机扩增多态性DNA标记（RAPD，Random Amplified Polymorphism DNA）是在酶和随机引物的作用下对DNA片段进行PCR扩增，随机引物是人工合成的随机多态核苷酸系列，通常为10个碱基对，然后通过DNA图谱分析扩增片段的差异[35]。最早通过RAPD技术研究月季的是Torres，区分出了5种月季品种[36]。RAPD 标记在月季的基因遗传分析中是一种灵敏、准确的工具，适合建立月季染色体连锁图谱[37]。郭立海通过RAPD技术将5个月季品种及5个家系准确地鉴别开来，但对每个家系内亲本和后代的鉴别十分困难[38]。最近，李玉洁以中国古老月季的新鲜幼叶为试材，进行RAPD分子标记反应扩增体系的优化，通过优化后的RAPD-PCR反应体系获得了清晰、稳定、条带多的电泳图;用40个RAPD引物在22个中国古老月季品种中共扩增出321个条带，在遗传距离为0.627 9时可将22个中国古老月季品种划分成两大类[39-40]。RAPD技术具有简单、方便、成本低等优点，非常适合分析大量群体，但其缺点是引物筛选工作量大，实验可重复性差和多态性不足。

2.5.3 SSR

简单重复序列标记（SSR，Simple Sequence Repeats）是使用PCR扩增简单重复DNA片段，通过电泳中检测SSR图谱的多态性，原理是植物基因组中有一类特殊的由1～6个核苷酸为重复单位的DNA片段，其两端含有稳定单拷贝碱基序列，将SSR两端碱基序列设计成特定的引物，可对SSR进行PCR扩增[41]。SSR是近年来在植物资源研究中应用最多的鉴定方法。我国学者邱显钦等利用优化体系对部分月季品种进行PCR扩增和电泳检测，扩增结果清晰且有较高的多态性，表明该体系适用于月季的遗传多样性分析;并对云南省主要分布的8种大花月季居群的遗传性进行分析，将14个野生月季品种分为6个群[42]。黄平运用SSR标记研究不同月季资源，得出近似结论[43]。张非亚、邱彤、杨旭等通过SSR标记花色分类[44-46]。SSR标记法成本低，程序简单易操作，多态性高，但是引物的设计和筛选比较困难。

2.5.4 AFLP

扩增片段长度多态性（AFLP，Amplified Fragment Length Polymorphism）的基本原理是通过对基因组DNA酶切片段的选择性扩增来检测DNA酶切片段长度的多态性，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性，其扩增片段多态性强。AFLP可用于形态差异不明显的品种鉴定，能将品种从其半同胞和全同胞品种中鉴别出来，但变种与其原种的AFLP差异不大[47]。Rajapakse采用AFLP技术建立了两张4倍体月季的遗传连锁图谱[48]。Leus对88个月季野生种和栽培品种做了AFLP分析，证明在野生种和栽培品种间存在较大的差异[49]。Anne对魁北克特有的2个月季品种进行了AFLP分析，表明这2个月季品种与另一分布广泛的月季品种实属同种[50]。王开锦对蔷薇属50个种/变种进行AFLP分析，表明变异程度随物种表现出明显差异[51]。AFLP具有多态性强、实验结果稳定、重复性好的优点，但实验对DNA纯度和内切酶的质量要求较高，操作程序繁琐、步骤多，要求很高的实验技能和精密的仪器设备，技术成本高，且需要放射性同位素的标记检测。

分子标记分类直接以核酸作为研究对象，在植物体的各个组织、各个发育时期均可检测，不受季节和环境的限制，与发育时期无关，这一点优于形态分类;分子标记数量极多，且多态性高，这一点优于细胞学分类;基因表现为中性，不受目标性状表达与否的限制，这一点优于同工酶法分类。

3 展望

我国月季资源丰富、类群多样、品种繁多，但至今缺乏统一的分类和命名准则，给月季的分类、鉴定和育种工作带来了困难。随着月季资源的不断发现和育种技术的飞速发展，特别是远缘杂交的成功率增大，种间、亚种间、属间遗传物质交叉渗透，新类群、新品种层出不穷，单一传统的园艺分类法已不能适应现代月季的分类和鉴定研究了。分子标记技术多态性强，分析结果稳定，不受环境的影响，是月季分类鉴定中强有力的辅助手段，已广泛应用于月季亲缘关系分析、遗传图谱构建和品种鉴定中[52]，其准确性和可靠性依赖选定DNA片段的代表性和数量。辅以分子标记的形态分类法应是月季分类鉴定研究的方向。选取一定数量的形态性状并编码，作为分类研究的规定性状;选取一种分子标记并规定所用引物，将试验程序标准化，以此建立一套严格的月季分类标准。建立表型性状数据库系统和分子指纹图谱，将植物鉴定结果长期分类保存，以供浏览和比对。新分类标准的建立，将对月季资源收集和新品种的鉴定起到直接促进作用;对判断资源的亲缘关系和育种起到辅助作用，对新品种栽培技术的制定起到指导作用。相信经过科学家的筛选和试验，一定能制定出一套科学的分类标准，助推月季资源的鉴定、分类、利用工作。

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（责任编辑：易  婧）