平贝母鳞茎腐烂病病原菌鉴定和药剂筛选

王爽 李新民 刘春来

摘要 为明确平贝母Fritillaria ussuriensis鳞茎腐烂病的病原菌及其防治，对病原菌进行分离、致病性测定，通过形态学特征、ITS rDNA、β-tubulin及EF-1α基因序列分析确定其病原为尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum和芳香镰刀菌F.redolens。通过菌丝生长速率法，对病原菌进行了室内药剂筛选，表明8种药剂中25%多菌灵可湿性粉剂和43%戊唑醇悬浮剂对病原菌有更好的抑制作用，处理第6天，EC50均不超过0.7 mg/L。对两种病原菌防效最好的药剂是戊唑醇，EC50分别为0.107、0.169 mg/L。这两种药剂可以选择应用于平贝母生产来防治茎腐病。

关键词 平贝母; 茎腐病; 尖孢镰刀菌; 芳香镰刀菌; 药剂筛选

中图分类号： S 435.67

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019167

Abstract To make clear the fungal pathogen species of the bulb rot of Fritillaria ussuriensis and the control， pathogens were isolated and their pathogenicities were tested. Based on morphological characteristics，ITS rDNA，β-tubulin and EF-1α gene sequences analysis， pathogens were identified were Fusarium oxysporum and F.redolens. Indoor inhibitory activity analysis of eight kinds of fungicides demonstrated that two kinds of fungicides including carbendazim 25% WP and tebuconazole 43% SC had better inhibitory effect on two pathogens. With EC50 values no more than 0.7 mg/L. Results showed that tebuconazole was the best agent to inhibit the mycelia of the two pathogens， with the EC50 values were 0.107 mg/L and 0.169 mg/L， respectively. Thus， these two kinds of fungicides can be recommended as alternative agents for field testing.

Key words Fritillaria ussuriensis; stem rot; Fusarium oxysporum; F.redolens; fungicide selection

平贝母是百合科Liliaceae贝母属Fritillaria多年生草本植物，现为中国药典收载品种，也是我国东北特产药材之一。其鳞茎性味平苦，具有清热解毒、润肺止咳化痰、散结消痛的功效，近代药理学表明，平贝母具有抗炎，抗血小板聚集，降血压，抗癌等功效[1]。随着供给侧结构改革和黑龙江省种植业结构调整的要求，近年来，平贝母的种植面积逐步扩大，但由于多年的连作，平贝母病害发生日趋严重，已严重影响平贝母种植业的发展[2]。国内已有报道的平贝母病害有：菌核病，病原为座盘菌Stromatinia rapulum[3]，主要为害平贝母鳞茎和茎基部;锈病，病原菌为百合单孢锈菌Uromyces lilli[4]，主要侵染茎叶，造成平贝母地上部分提前枯萎死亡;灰霉病，病原菌为椭圆葡萄孢菌Botrytis elliptica[5]，主要侵染叶片、茎、花、幼果，后期导致植株枯萎死亡;根腐病，病原菌为茄镰刀菌蓝色变种Fusarium solani[6]，主要危害根，部分或全部变色腐烂，组织遭到破坏，茎、叶也因根部无法供应水分而下垂，干枯;黑腐病，病原菌为Sclerotium denigrans和Sclerotinia sclerotiorum[7]，鳞片被害时产生黑斑，病斑下组织变灰，严重时整个鳞片变黑，皱缩干腐，鳞茎表皮下形成大量小米粒大小的黑色菌核。

海林地区平贝母的总种植面积有466.7 hm2，其中横道河子镇的平贝母种植面积有333.3 hm2，多为农户种植，每户种植667～1 334 m2。平贝母均有不同程度的腐烂病发生，田间表现为种植的次年不出苗，或相邻地块不出苗。地下鳞茎腐烂，严重地块腐烂面积达80%，几乎绝产，造成了该地区平贝母产业的巨大经济損失。2018年5月对该地区的病样进行了采集，病原菌的分离和鉴定及室内防治药剂筛选工作。以期为该地平贝母病害的有效防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

平贝母病样于2018年5月31日采自海林横道河子镇二十二村平贝母种植基地。培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL;马铃薯蔗糖琼脂（PSA）：马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL。

供试药剂：250 g/L嘧菌酯悬浮剂，先正达南通作物保护有限公司;80%代森锰锌可湿性粉剂，美国陶氏益农公司;25%多菌灵可湿性粉剂，江西中讯农化有限公司;20%腐霉利悬浮剂，江西禾益化工有限公司;70%甲基硫菌灵可湿性粉剂，山东省济南一农化工有限公司;43%戊唑醇悬浮剂，拜耳股份公司，珠海经济特区瑞农植保技术有限公司分装;25%溴菌腈乳油，江苏托球农化股份有限公司;500 g/L异菌脲悬浮剂，苏州富美实植物保护剂有限公司。

试剂及仪器：真菌基因组DNA快速抽提试剂盒、DNA纯化试剂盒、酶均购自康为世纪生物科技有限公司。引物ITS1/ITS4、B36F/B12R由华大基因科技服务有限公司合成。纯化的PCR产物送华大基因科技服务有限公司完成序列分析。人工培养箱，上海福玛实验设备有限公司;Power Pac 200 Bio-Rad电泳仪;Biofuge离心机D-37520;Eppendorf Mastercycler PCR仪;OLYMPUS BX43F生物学显微镜。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离

采用常规组织分离方法进行病原菌的分离。无菌水冲洗感病鳞茎，无菌滤纸吸干表面水分，选取病健交界处组织，切取2～3 mm大小的组织，70%乙醇消毒10 s，再用0.1%的升汞表面消毒2～3 min，无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干水分后，将组织块置于添加链霉素的PDA平板上，置25℃恒温培养箱黑暗培养，待形成菌落后进行菌丝先端挑取纯化，将纯化的菌株接种于PDA斜面培养后，放于4℃冰箱中保存备用。

1.2.2 菌株致病性测定

根据柯赫氏法则，采用离体接种法将分离的菌株接种于PDA平皿培养7 d，7 mm打孔器打菌碟备用。选取健康平贝母植株鳞茎，冲洗干净后用70%乙醇表面消毒处理30 s，无菌条件下切去毛细根和地上部分，放于铺有滤纸的无菌培养皿内，在鳞茎上部用针刺伤口并放置分离的菌饼，以不加菌饼作为对照，25℃保湿培养，定期观察直至出现发病症状。对发病组织部位进行再分离，最后通过培养性状观察和普通显微镜镜检结果，确定分离得到的病原菌与初接病原菌是同一病菌。

1.2.3 病原菌的鉴定

形态学鉴定：纯化的病原菌接种于PSA、PDA平板，25℃黑暗培养4～14 d，观察记录菌落生长情况;显微镜下观察菌丝与产孢情况。参照《常见镰刀菌鉴定指南》[8]《镰刀菌属》[9]中对镰刀菌的形态特征描述确定其分类地位。

分子生物学鉴定：将纯化的病原菌菌株接入PDA平板培养7 d，以灭菌牙签刮取菌丝 1 g左右，加入液氮快速研磨。采用真菌基因组DNA提取试剂盒，参照试剂盒说明书进行DNA提取，电泳观察，最后将抽提的DNA于-20℃保存备用。选用扩增真菌18S序列的通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。PCR反应体系为2×Taq PCR Master Mix缓冲液25 μL，10 μmol/L引物各2 μL，真菌基因组DNA 2 μL，ddH2O加至50 μL。PCR反应条件：95℃ 预变性5 min;94℃变性1 min，55℃ 退火1 min，72℃ 延伸1.5 min，35个循环;72℃延伸10 min;4℃保存。选用扩增真菌β-tubulin序列引物B36F（5′-CACCCACTCCCTCGGTGGTG-3′）、B12R（5′-CATGAAGAAGTGAAGACGCGGGAA-3′）。PCR反应体系同上。PCR反应条件：预变性94℃ 4 min;94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，30个循环;72℃延伸10 min。选用EF-1α引物EF-1（5′-ATGGGTAAGGARGACAAGAC-3′）、EF-2（5′-GGARGTACCAGTSATCATGTT-3′），PCR 反应体系同上。PCR 扩增程序为：94℃预变性 3 min;94℃变性 30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s， 35个循环;最后 72℃延伸 10 min。PCR扩增产物用1% 琼脂糖凝胶电泳，送华大基因公司测序。

序列提交GenBank核酸序列数据库（https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行同源性搜索。找出与获得片段同源性最高的真菌菌株参考序列。

1.2.4 杀菌剂对病原菌的室内药剂筛选

按药剂标识常用浓度设定3个浓度梯度，初步淘汰抑菌效果较差的药剂。后根据筛选结果调整设定5个药剂浓度梯度，做回归方程。药剂用无菌水稀释相应浓度后，添加到45～50℃的PDA培养基中，制成混药培养基，使其培养基药剂有效成分含量为设置浓度（见表1），每处理4个重复。对照组加入等量无菌水。直径5 mm的PDA病原菌菌饼，接种于含药平板中央， 25℃恒温培养箱黑暗培养。6 d后，按十字交叉法测量菌落直径，取其平均值。菌丝生长抑制率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-菌饼直径）×100%。

1.3 数据分析

SPSS 13.0分析软件根据各药剂浓度对数值及相对应的菌丝生长抑制率几率值作回归分析。

2 结果与分析

2.1 病害症状

染病叶片初为水浸状，后期淡紫色，最后黄色枯萎，地下鳞茎局部变软棕褐色腐烂，严重者内部完全腐烂只剩鳞茎的皮或整体腐烂殆尽。

2.2 病原菌分离和鉴定

2.2.1 病原菌分离和致病性测定

经离体接种试验，可导致平贝母鳞茎发病腐烂的菌株有两类，分别以P6-1和P4-3为代表。接种P6-1菌株后，平贝母鳞茎表面附着浓密菌丝体，鳞茎内部变软腐烂，20 d后只剩一层菌丝包裹的皮;接种P4-3菌株后，平贝母鳞茎表现为接种部位变褐色、变软腐烂直至整个鳞茎（图2）。通过培养性状观察和普通显微镜镜检结果，确定分离得到的病原菌与初接病原菌是同一病菌。

2.2.2 病原菌的鑒定

经显微镜观察菌株P6-1、P4-3均有镰刀菌的特征，在PDA和PSA培养基上的形态无明显差异。PDA培养基上两菌株上的菌落初期均为白色。后期菌株P6-1的菌落为紫色，4 d的菌落直径为4.2～4.5 cm，其菌丝体呈绒卷毛状，小型分生孢子卵圆形或肾形，着生在侧生瓶状小梗上或假头状着生，大小（4.73～12.78）μm×（2.12～3.94）μm，大型分生孢子美丽型，月牙形，稍弯，向两端比较均匀的变尖，基胞足跟明显，多2～3隔，大小（13.7～28.41）μm×（2.76～4.54）μm，易产生厚垣孢子，直径9.64～14.71 μm。菌株P4-3菌落后期为米色，4 d的菌落直径为3.95～4.2 cm，其菌丝体低平，毛状（直立），小型分生孢子卵圆形着生在侧生瓶状小梗上或假头状着生在产孢细胞上，大小（4.94～17.39）μm×（272～4.63）μm，大型分生孢子介于美丽型和马特型之间，比尖孢镰刀菌稍宽，两端比尖孢镰孢较钝。少有分隔，分隔不明显，大小（13.47～30.78）μm×（35～4.99）μm，易产生厚垣孢子，直径8.69～1157 μm（图3、4）。

菌株P6-1和P4-3采用通用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增后得到的片段收录在GenBank，登录号分别为MK510933、MK510931。将供试菌系的rDNA-ITS序列于GenBank数据库进行 BLAST 同源性比对。分别与登录号为MH911386的F.oxysporum和登录号为MH660908的F.redolens相似度为100%。菌株P6-1和P4-3通过β-tubulin基因PCR扩增和测序分析得到的序列分别与收录在GenBank登录号为KJ127286的F.oxysporum和登录号为KU171788的F.redolens的遗传距离最近。菌株P6-1和P4-3通过EF-1α基因PCR扩增和测序分析得到的序列通过构建系统发育树发现分别与收录在GenBank登录号为KX940969的Foxysporum和登录号为KF055839的F.redolens的遗传距离最近，聚在一起（图5）。结合形态学观察确定这两种病原菌为尖孢镰刀菌和芳香镰刀菌。

2.3 杀菌剂对病原菌的室內药剂筛选

2.3.1 初筛

结果表明，供试的8种药剂对病原菌的抑制效果明显不同，其中多菌灵和戊唑醇表现出很好的抑菌效果，相对少的用量对2种病原菌有着相对高的抑菌率，其他药剂的用量高且防效差。多菌灵每升PDA培养基有效成分含量2 mg的浓度下，第6天对两种病原菌的菌丝抑制率均超过了95%。戊唑醇每升PDA培养基有效成分含量1.72 mg的浓度下，第6天对两种病原菌的菌丝抑制率均超过了78%（表1）。

2.3.2 多菌灵和戊唑醇对病原菌的抑制作用

结果表明2种药剂对2株病原菌的EC50均不超过0.7 mg/L，对尖孢镰刀菌和芳香镰刀菌菌丝抑制率最好的药剂是戊唑醇，其EC50分别为0107、0169 mg/L（表2）。

3 讨论

目前还没有关于平贝母由尖孢镰刀菌和芳香镰刀菌引起病害的报道。高启超等报道，尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌F.moniliforme和茄病镰刀菌可以引起安徽贝母F.anhuiensis鳞茎腐烂，并指出用50%的多菌灵或硫菌灵和40%甲基异柳磷1 000倍混合药液浸种30 min，晾干后播种， 能杀死鳞茎表面的病菌[10];廖蔚文等报道燕麦细镰孢霉F.avenaceum可以引起湖北五峰县栽培贝母的干腐病，用40%多菌灵胶悬剂50倍液浸种，次年3月成苗率为93.3%，而对照为67.7%[11];周茂繁等报道湖北贝母F.hupehensis烂种病原为尖孢镰刀菌，并指出40%多菌灵胶悬剂500倍液浸种具有很好的防效[12];此外尖孢镰刀菌可以引起与贝母同科的百合鳞茎腐烂病，在百合种球播种前，使用多菌灵浸种，可有效预防病害发生[13]。尖孢镰刀菌和芳香镰刀菌可以寄生多种植物[14]，这两种病原菌同属美丽组镰刀菌，形态上芳香镰刀菌介于尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌之间且这两个种的多数类群是多种作物严重枯萎的主要病原[9]。本试验证明多菌灵和戊唑醇对这两种病原菌有很好的抑制作用，且戊唑醇的致死中浓度更低。

平贝母既可进行有性繁殖，又可进行无性繁殖。用种子繁殖生长周期长，收益较慢，一般需 6年左右方能收获;用鳞茎繁殖，2年便可收益，故生产上多采用鳞茎繁殖法[15]。所以对平贝母鳞茎腐烂病的防治显得尤为重要。

本研究首次提出平贝母茎腐病的两种新的病原菌，并对当前常用药剂对其防效进行了筛选，对平贝母鳞茎腐烂病害防治有一定的指导作用。本试验只对病原菌进行了室内的药剂筛选，田间防治效果有待进一步试验研究，但是田间药剂筛选应用还需综合考虑环境、施药方式、对平贝母鳞茎的影响及农药残留等多种因素。

参考文献

[1] 赵帅. 平贝母内生菌的分离鉴定及抑菌活性菌株筛选[D].长春：吉林农业大学，2016.

[2] 孔祥清，孔祥森，林春驿. 平贝母菌核病的药剂防治试验[J]. 农药，2006，45（10）：710-711.

[3] 由士江，于洪君，李双福. 平贝母菌核病的防治研究[J]. 吉林林业科技， 2005，34（3）：27-29.

[4] 朱瑞玮，郑春江. 几种生物农药防治平贝母锈病试验[J]. 黑龙江农业科学，2008（3）：76-77.

[5] 韩继堂，黄瑞贤，陈丽波，等. 平贝母灰霉病的发生、流行与防治[J].中国植保导刊，2009，29（11）：31.

[6] 日孜旺古丽·苏皮，凯撒·苏来曼，阿衣别克. 贝母根腐病病原鉴定和生物学特性研究[J].天津农业科学，2015，21（3）：118-121.

[7] 宋小双，遇文婧，尹大川，等. 平贝黑腐病病原菌分离鉴定和生物学特性的初步研究[J]. 中国森林病虫， 2016，35（3）：7-11.

[8] 王拱辰，郑重，叶琪明，等. 常见镰刀菌鉴定指南[M]. 北京：中国农业科技出版社，1996：41-42.

[9] 陈其煐，译.镰刀菌属[M]. 北京：农业出版社，1988：167-202.

[10]高启超，程新霞，曹金择. 贝母鳞茎腐烂病及其防治[J]. 特产科学实验，1987（3）：35-36.

[11]廖蔚文，冯家旺. 贝母腐烂病研究初报[J]. 植物保护，1987，13（4）：26-27.

[12]周茂繁，鲁鸿钜，杨东，等. 湖北贝母烂种原因和防治方法的研究[J]. 华中农业大学学报， 1989， 8（1）：23-28.

[13]梁巧兰，徐秉良，刘艳梅. 观赏百合根腐病病原鉴定及药剂筛选[J].甘肃农业大学学报，2004， 39（1）：25-28.

[14]陈鸿逵，王拱辰.浙江镰刀菌志[M].杭州：浙江科学技术出版社， 1992：27-30.

[15]韩家永，张国锋，宋成江，等. 林区平贝母栽培技术[J]. 林业勘查设计，2011，40（4）：110-111.

（责任编辑：田 喆）