百合新病原菌假短孢弯孢生物学特性及其对杀菌剂的敏感性

李润根 卢其能 何咪

摘要 假短孢弯孢Curvularia pseudobrachyspora是我国新记录种，首次在龙牙百合贮藏期腐烂鳞茎上发现，并能引起龙牙百合叶斑病。为明确其生物学特性及其对药剂的敏感性，研究了不同碳源、氮源、pH、光照、温度等处理对病原菌菌丝生长的影响，并采用菌丝生长速率法测定该病原菌对9种杀菌剂的敏感性。研究表明，最适合菌丝生长的碳源为麦芽糖和木糖，氮源为牛肉浸膏，pH为7.0～8.0，最适温度为30℃，致死温度为52℃，黑暗条件有利于菌丝生长，病原菌可以侵染马铃薯、甘薯、荠菜，不能侵染蒜、葱。在9种参试杀菌剂中，1%申嗪霉素SC对该病原菌的毒力最高，相应的抑制中浓度EC50为0.012 mg/L;68%精甲霜·锰锌WG的毒力最低，EC50为15.820 mg/L。

关键词 百合; 假短孢弯孢; 形态特征; 生物学特性; 药剂敏感性

中图分类号： S 436.44

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019414

Abstract Curvularia pseudobrachyspora is a new record in China. It was found for the first time on the rotten bulbs of Longya lily during storage and could cause the leaf spot of Lilium brownii var. viridulum. The biological responses of the pathogen to different carbon sources， nitrogen sources， pH and light treatments were also studied. The results showed that the most suitable carbon sources were xylose and maltose; the most suitable nitrogen source was beef extract; the optimum temperature for the mycelium growth was 30℃，and the mycelium lethal temperature was 52℃; the optimum pH for the mycelium growth was 7.0-8.0， and the suitable light condition for the mycelium growth was 24 h dark. The sensitivity of the pathogen to nine fungicides was tested， and the results showed that the inhibitory effects of six fungicides on the mycelium growth of the pathogen were significant. The fungicide shenqinmycin 1% SC had the strongest inhibitory effect among the fungicides tested， with an EC50 value of 0.012 mg/L. The fungicide metalaxyl-M·mancozeb 68% WG had the minimum inhibitory effect， with an EC50 value of 15.820 mg/L.

Key words Lilium brownii var. viridulum; Curvularia pseudobrachyspora; morphological characters; biological characteristics; sensitivity to fungicide

百合Lilium spp.在中國栽培历史悠久，其具有作为花卉的观赏价值，而地下鳞茎又可食用，营养丰富，药用价值突出，属药、食兼用型植物，因此有着很高的开发利用价值[1]。龙牙百合是我国三大食用百合之一，在江西、湖南、广西等地广泛栽种，取得了较好的经济效益。但是龙牙百合是一种较易感病的作物，特别是连作时病害严重。随着龙牙百合栽培面积的不断扩大，病害发生越来越多，已经成为百合产业发展的重要问题之一[2]。已有报道，江西田间百合种植的主要病害有镰孢枯萎病、疫病、灰霉病、炭疽病、病毒病和叶斑病等26种[3]。

百合叶斑病为百合叶点霉Phyllosticta lilicola Saccarda引起[3]，截至2017年尚未见弯孢属真菌引起百合叶斑病的相关报道。2017年，假短孢弯孢Curvularia pseudobrachyspora最先在泰国的牛筋草Eleusine indica上被发现[4];2018年，笔者在龙牙百合贮藏期腐烂鳞茎上发现该弯孢菌，并证明它能引起龙牙百合鳞茎腐烂和叶斑病[5]，是我国新记录种，NCBI登录号分别为：MH819562（ITS1/4）、MH822836（TEF1-α：EF1-983F/EF1-2218R）、MH822837 （GAPDH）、MN061051（LSU：LROR/LR5）和MN061045（18S：NS1/NS4）。为进一步掌握假短孢弯孢的生物学特性和室内筛选适宜的防治药剂，为有效防治百合叶斑病提供理论基础，特进行本试验。

1 材料与方法

1.1 材料

病原菌假短孢弯孢C.pseudobrachyspora为本实验室于2017年10月分离自江西省万载县高城镇绿泉合作社冷库（0～4℃）贮藏的龙牙百合Lilium brownii var. viridulum的腐烂鳞茎，病原菌已进行形态学与分子鉴定。

室内抑菌试验供试药剂及生产厂家见表1。

1.2 假短孢弯孢形态特征观察

将分离纯化获得的菌株转接到马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）上，置于25℃培养7 d。观察菌落整体形态特征，并挑取生长旺盛的菌丝制成玻片，在显微镜下观察分生孢子和分生孢子梗形状，测量孢子大小，观察产孢量和产孢特性;采用常规的玻片培养法，25℃下培养7 d，观察并记录分生孢子的着生状态并拍照。

1.3 假短孢弯孢生物学特性

1.3.1 病原菌生长温度和pH测定

将直径5 mm的病原菌菌块接种到马铃薯蔗糖琼脂（potato saccharose agar，PSA）平板培养基中央，设置5、10、15、20、25、30、35、40℃等8个不同培养温度处理。以PSA为基础培养基，用0.1%的NaOH和HCl溶液调配pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的培养基，25℃培养。

1.3.2 光照对病原菌生长的影响

将直径5 mm的病原菌菌块接种到PSA平板中央，25℃培养，光照条件分别为连续光照、连续黑暗、L∥D=12 h∥12 h光暗交替和自然光照。

1.3.3 适宜病原菌生长的培养基碳、氮源筛选

以查氏（Czapek）培养基为基础培养基，以KNO3为氮源，碳源总质量浓度为12.63 g/L，选择6种不同的碳源：乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉，用不加碳源作对照。以蔗糖为碳源，氮源总质量浓度为0.33 g/L，选择11种不同的氮源：硝酸钠、精氨酸、酵母浸膏、氯化铵、天冬酰胺、硝酸铵、硝酸钾、尿素、硫酸铵、牛肉浸膏、蛋白胨，以无氮源培养基为对照。两种处理均25℃培养。

1.3.4 病菌致死温度测定

將直径5 mm的病原菌菌块放置于装有1 mL无菌水的灭菌离心管中，分别置于45～75℃（设置梯度5℃）的恒温水浴中处理10 min（先预热1 min）后取出迅速冷却。将处理过的菌块置于PSA平板培养基中，25℃恒温培养，连续观察7 d。先以相隔5℃梯度确定致死温度范围，然后相隔1℃设置梯度重复以上试验，确定菌丝致死温度。

1.3.5 病原菌对不同作物的致病性

取自大田的马铃薯、荠菜、甘薯、蒜、葱等作物的健康叶片，用流水冲洗后，70%乙醇消毒30 s，再用2%次氯酸钠消毒5 min，切取适宜长度用无菌滤纸吸干水分，放在事先灭过菌的垫有滤纸的培养皿中，背面朝上，每皿放3片，保湿培养，将菌饼接种在叶片背面，以接种无菌PSA块为对照，置于25℃恒温培养箱中培养，观察叶片被浸染的情况。

所有处理均设4次重复。

1.4 假短孢弯孢对杀菌剂的敏感性

选用9种药剂（表1）对病原菌进行室内毒力测定，采用菌丝生长法测定其对龙牙百合叶斑病病原菌的抑制作用。经预试验后，对假短孢弯孢菌丝生长抑制率在5%～95%范围内的6个质量浓度（精甲霜·锰锌稀释1 000、10 000、50 000、100 000、200 000、500 000倍;己唑醇、唑醚·啶酰菌、肟菌·戊唑醇、咪鲜胺锰盐、腈菌唑、嘧菌酯稀释1 000、10 000、50 000、200 000、400 000、1 000 000倍;申嗪霉素、抑霉唑稀释50 000、100 000、200 000、500 000、1 000 000、2 000 000倍），制作含药介质培养基，药剂需要在培养基冷却至55℃以下时加入。将5 mm菌饼接种到含杀菌剂的平板中央，每处理重复3次，以加入灭菌蒸馏水的培养基平板为对照，于25℃下倒置培养，对照处理的菌丝生长直径大于70 mm后，量取各平板中菌落的直径，计算抑菌率。将抑菌率换算为几率值、药剂浓度换算为对数值进行计算[6-7];利用SPSS 22.0软件求出毒力回归方程、相关系数和EC50。

2 结果与分析

2.1 假短孢弯孢形态特征

菌落在PDA平板上呈圆形，中央隆起，初期铺展生长，颜色为灰色、淡褐色或墨绿色，边缘和表面一层的菌丝为灰白色;菌落绒状，生长较快，7～8 d几乎长满直径90 mm的培养皿（图1a、b）。后期菌丝形成黑色伞形子座（图1e、f）。分生孢子梗褐色有隔膜， 单生或分支， 顶端直或弯曲。分生孢子2～5个簇生（图1c、d），淡褐色或深褐色，具有3～4个隔膜，孢子大小和颜色不均匀，中间两个细胞膨大且颜色较深，两端两个细胞较小且颜色浅，从基部向上数第3个细胞最大，颜色最深，向一侧明显弯曲。分生孢子形态多样，有弯曲、不对称的弯月状，直短棒状，梨形等，分生孢子大小为21.70（13.66～28.32）μm×9.94（5.72～15.00）μm（图1g）。

2.2 假短孢弯孢生物学特性

不同温度对假短孢弯孢菌丝生长的影响具有一定的差异（图2a）。病原菌在10～40℃范围内均可生长，在20～30℃下生长最快，在40℃时生长极为缓慢，温度低于5℃时菌落几乎停止生长。

在7种pH环境下菌丝均可生长，但在不同pH条件下生长速度不同，其中pH为7.0和8.0时最利于菌丝生长（图2b）。

在供试的7种碳源上菌丝均可生长，但在不同碳源上生长速度不同，其中木糖和麦芽糖最利于菌丝生长（表2）。

与不加氮源的对照相比，各供试氮源除硫酸铵外其他氮源对病原菌菌丝生长均具有显著促进作用（表3），7 d时各不同氮源下的菌落直径的大小排序依次为：牛肉浸膏>蛋白胨>精氨酸>尿素>硝酸钠>硝酸钾>酵母浸膏>天冬酰胺>氯化铵>硝酸铵>硫酸铵>无氮源对照，以牛肉浸膏为氮源时菌丝生长最快，以硫酸铵为氮源时菌丝生长最慢。在无氮源条件下病原菌虽然能生长但菌丝很稀疏，需要在透射光下才可看见。

不同光照条件下假短孢弯孢菌丝生长有些差异，黑暗条件下菌丝生长较好，优于其他条件，但与光暗交替条件下菌丝的生长差异不显著（表3）。

假短孢弯孢菌株在温度45～50℃经10 min处理的菌丝在PSA培养基上均能继续生长，但在52℃ 10 min和53℃ 10 min处理的菌丝不再生长。表明该菌菌丝的致死温度是52℃，10 min。

另外，病原菌菌块接种至马铃薯等其他5种植物的叶片后，第7天观察到马铃薯、荠菜的叶片上菌丝生长较旺盛，几乎长满叶片，接种叶片呈水浸状，显示其可以侵染马铃薯、荠菜;甘薯叶片上的菌丝较少，但叶片出现失绿变褐呈水浸状，而对照组叶片无明显变化，因此认为此病原菌可侵染甘薯，但不侵染蒜和葱（图3）。

2.3 假短孢弯孢对杀菌剂敏感性

室内毒力测定结果表明，9种药剂对假短孢弯孢菌株均有一定的抑制作用。根据杀菌剂浓度与病原菌菌丝生长程度相关的回归方程可知，随着杀菌剂浓度的增加抑制作用增强。根据EC50可知，不同

药剂之间的抑制作用差异较大。其中1%申嗪霉素SC抑制作用最强，EC50为0.012 mg/L;其次是20%抑霉唑EW，EC50为0.190 mg/L;再次是38%唑醚·啶酰菌WG，EC50为0.277 mg/L;68%精甲霜·锰锌WG的效果最差，EC50为15.820 mg/L（表3）。

由毒力回归方程可知，1%申嗪霉素SC斜率值最大，68%精甲霜·锰锌WG其次，250 g/L嘧菌酯SC斜率值最小，说明假短孢弯孢对申嗪霉素最敏感，对精甲霜·锰锌较敏感，而对嘧菌酯最不敏感（表3）。

取杀菌剂稀释50 000倍时的抑菌率进行方差分析。结果显示，1%申嗪霉素SC和20%抑霉唑EW的抑菌率分别为99.3%和92.3%，两者有显著差异，且均极显著高于其他药剂。38%唑醚·啶酰菌WG、50%咪鲜胺锰盐WP、30%己唑醇SC、75%肟菌·戊唑醇WG抑菌效果较好，抑菌率都大于等于70%。40%腈菌唑WP、68%精甲霜·锰锌WG、250 g/L嘧菌酯SC抑菌效果一般，抑菌率在50%以上;嘧菌酯和精甲霜·锰锌抑菌效果差，极显著低于其他药剂（表3）。

3 小结与讨论

本试验中的病原菌假短孢弯孢与Marin-Felix等[4]研究的病原在形态学上相近，但分生孢子稍小，子座与黄微等[8]报道的弯孢菌的相同。

研究病原菌的生物学特性对掌握病害的发生规律和提出防治措施具有非常重要的意义。在对百合假短孢弯孢的生物学特性进行研究时发现，在 PSA 培养基上 30℃ 培养时，菌丝生长速率大于10 mm/d，因此百合栽培时要在温暖季节及时防治该病菌。该菌在含有硫酸铵的培养基上生长最慢，有研究表明，百合枯萎病菌Fusarium proliferatum[9]、F.oxysporum[10]和高粱附球菌Epicoccum sorghinum[11]都有类似结果，硫酸铵又属生理性酸性肥料，本研究也表明，pH为4.0时不利于该菌菌丝生长，生产上施用硫酸铵是否能缓解其发病以及偏酸性土壤能否减轻龙牙百合栽培病害等均有待进一步研究。

目前已报道的弯孢菌属病原菌主要是新月弯孢Curvularia lunata，该菌是一种单子叶作物的兼性病原菌，引起玉米叶斑病、高粱叶枯病、大麻叶斑病、甘蔗幼苗枯萎病[12]、水稻叶斑病[13]、温郁金叶斑病[14]，也有报道引起辣椒叶斑病[15]、再力花叶枯病[16]等。假短孢弯孢是我国新记录种，试验表明，该菌不仅侵染百合（单子叶作物），还能侵染马铃薯、甘薯、荠菜等双子叶作物，对其他作物致病情况有待进一步研究。

菌丝生长速率法测定结果表明，选用的9种杀菌剂对假短孢弯孢菌丝生长都有一定的抑制作用。1%申嗪霉素SC在EC50、毒力回归方程斜率和抑菌率等方面均表现效果最好，徐辉[13]在水稻弯孢叶斑病防治试验中也发现申嗪霉素防效较好，申嗪霉素是由荧光假单胞菌M18经生物培养分泌的一种抗菌素，具有广谱、高效、安全的特点，能有效控制真菌性根腐和莖腐，其作为一种新型微生物源绿色农药，对百合镰刀菌枯萎病[9]、百合米根霉腐烂病[17]等均防效良好，推荐百合生产中选用;咪鲜胺锰盐对于弯孢霉的抑菌效果较好，与黄娴等[18]对温郁金弯孢霉叶枯病病原菌的药剂筛选结果相似。本试验也首次得出申嗪霉素和抑霉唑对于弯孢菌具有较好的抑制作用。室内毒力测定结果只能说明该杀菌剂在室内离体条件下对百合假短孢弯孢有一定的杀菌活性，而田间防治效果受很多因素的影响，因此在应用于大田防治前还需进一步的田间试验证实其效果。

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（责任编辑：田 喆）