红曲霉菌株CS-5筛选及不产桔霉素机理研究

杨华　刘丹　马博雅　王旭锋　李贞景　陈勉华　王昌禄

摘要 对从红曲米中分离出来的12株红曲霉进行桔霉素产量检测，筛选出一株在大米培养基和YES培养基中均不产桔霉素的红曲霉菌株CS-5。对CS-5进行基因分析，发现在红曲霉CS-5的桔霉素合成基因簇中缺少ctnA和ctnE基因（ctnA是桔霉素合成途径中的激活基因，ctnE是脱氢酶的编码基因）;红曲霉CS-5上ctnF和ctnH基因与Monascus aurantiacu（Gen Bank accession No.EU309474）同源基因（ctnF和ctnH基因分别编码变位酶和短链脱氢酶）同源性仅为71%和76%;同时发现，orf5基因（编码膜转运蛋白）在mRNA上不表达。结果表明：红曲霉的桔霉素发酵特性与其基因结构紧密相关。ctnA和ctnE基因的缺失、ctnF和ctnH基因的低同源性以及orf5基因不表达可能导致桔霉素合成途径被中断或桔霉素无法被转运到细胞膜外。这些可能是导致红曲霉CS-5不产桔霉素的关键原因。该研究为根据基因结构筛选不产桔霉素的红曲霉菌株提供了理论依据。

关键词 红曲霉CS-5;桔霉素;同源性

中图分类号 TS 264.4文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）23-0206-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.23.053

Selection of Monascus CS-5 and Mechanism of No-citrinin

YANG Hua1，2，LIU Dan1，2，MA Bo-ya1，2 et al

（1.State Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Tianjin 300457;2.College of Food Science and Engineering，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457）

Abstract 12 strains of Monascus isolated from red-rice，and ability of citrinin production were detected，then strain CS-5 which no citrinin produced neither in rice medium nor in YES medium was screened.Results of CS-5 gene analysis showed that strain CS-5 lacks ctnA and ctnA gene （citrinin biosynthesis gene activator and dehydrogenase encoding gene respectively） in citrinin biosynthesis gene cluster，ctnF and ctnH gene （encode mutase and short-chain dehydrogenase respectively） in CS-5 on the homology of only 71% and 76% to the Monascus aurantiacu（Gen Bank accession No.EU309474）.The orf5 gene （encoding a membrane transporter protein） didnt not express on mRNA level.The citrinin fermentation characteristics were closely related to their genetic structure.Lacking of ctnA and ctnE， low homology of ctnF and ctnH，orf5 didnt express at the mRNA level caused citrinin biosynthetic pathway interrupted or cant be transported outside the cell membrane.These maybe the reason why Monascus CS-5 didnt produce citrinin.This study provided a theoretical basis for screening strains of Monascus that do not produce citrinin based on genetic structure.

Key words Monascus CS-5;Citrinin;Homology

紅曲霉（Monascus）是一种在食品和医药行业有广泛应用的丝状真菌。1995年，相关研究学者发现，红曲霉在产生对人体有益的生物活性物质（如 Monacolin K、γ-氨基丁酸以及红曲色素等）的同时，还会产生一种真菌毒素——桔霉素，桔霉素具有肾毒性，因此桔霉素的生成很大程度上制约了红曲霉的广泛应用[1]。

由于桔霉素与色素同时存在，所以含有色素的红曲菌产品中常常含有桔霉素。除了红曲产品外，还检测到其他易受霉菌毒素污染的产品，例如食品、动物饲料等都可能含有桔霉素[2]。 关于葡萄牙霉菌毒素暴露评估的一份报告显示，可以从尿液样本中检测出桔霉素[3]。 研究还发现，桔霉素可以与

其他霉菌毒素（如赭曲霉毒素A）协同作用，以提高彼此的毒性[4]。很多国家和地区为红曲产品中的桔霉素残留量设定了限制标准。因此，减少红曲霉产品中桔霉素的残留是促进红曲霉产业发展的重要举措。

近年来，很多学者通过发酵条件优化、基因突变、基因敲除、基因沉默等方法从发酵和分子层面对红曲霉桔霉素的产生机制和调控途径进行研究，并取得了一定进展。Shimizu等[5]通过对紫色红曲菌（M.purpureus）的研究，得到了与桔霉素合成相关的PKS基因簇，包括pksCT及其上下游的5个开放阅读框。在此基础上，Li等[6]继续对M.aurantiacus基因组文库进行筛选和克隆后得到了另外10个ORF（图1）。

作为基因簇中桔霉素合成的关键聚酮合酶基因pksCT，其功能存在不同解释，李琦等[7]敲除了紫色红曲菌株J01基因组中的pksCT基因后，发现基因缺失菌株的菌丝体中未检测出桔霉素;殷博薇[8]和张淑云等[9]发现pksCT基因敲除后仍有部分桔霉素合成，pksCT基因并不是红曲霉合成桔霉素的唯一关键基因。 Ning等[10]研究发现ctnE缺失后，该菌株代谢产桔霉素的量与原菌株相比减少了96%，表明ctnE基因对桔霉素合成代谢有重要影响;ctnA基因敲除后[11]，pksCT和orf5转录的大量减少，且几乎检测不到桔霉素的产生，表明pksCT和orf5基因受ctnA产物的控制;在其他研究中，orf1、orf2、ctnG以及ctnB 基因的缺失也会造成桔霉素产量显著降低，但不会完全消失[6，12-13]。此外，基因orf6，orf7和ctnRI基因上调均与抑制桔霉素的合成有关。orf6和ctnRI缺失均会导致桔霉素产量升高，可能是这2个基因作为调节因子对桔霉素的合成进行反馈抑制[14]。

虽然多项研究都在对桔霉素合成调控基因进行研究，但是单个基因，包括聚酮合酶关键基因pksCT和基因簇激活基因ctnA的缺失都无法使桔霉素合成彻底消失，这说明这些基因只决定桔霉素产量，并不直接决定桔霉素是否彻底合成。桔霉素的合成可能并不是由单个基因决定的，而是由多个基因共同决定。通过环境因子对桔霉素合成的影响研究发现，缺氧使ctnA基因表达量上调和orf7基因表达量下调，同时桔霉素产量减少，故进一步推测桔霉素合成的调控可能是多个基因协同作用结果[15]。用蓝光照射红曲霉后，基因orf1、orf3、orf4 （ctnB）表达量上调且桔霉素产量提高，也表明桔霉素合成是由多个基因共同作用结果[16]。

虽然在分子生物学领域，桔霉素合成的相关基因已经被分离和鉴定出来，但是仍未从根本上解决桔霉素残留问题。桔霉素的合成是由多个基因决定的，即使同一基因，基因序列的差异也可能影响最终表达，从而影响桔霉素生成。因此，单个基因功能的研究具有局限性。筛选不产桔霉素的红曲霉菌株，并对其基因结构进行分析，有助于更深入了解桔霉素合成机理。

该研究从红曲米中分离的12株红曲霉中筛选出一株在大米培养基和YES培养基中均不产桔霉素的红曲霉菌株CS-5。通过对CS-5的基因结构和基因表达两方面进行分析，进而阐述其不产桔霉素的原因。通过对CS-5不产桔霉素特性的研究，为开发更安全的红曲霉发酵产品提供理论支持，同时也为从基因结构鉴定和筛选不产桔霉素的红曲霉菌株提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 红曲霉CS-5保存在天津科技大学食品科学与工程学院发酵食品与微生物资源开发研究室。

试剂：色谱纯甲醇、色谱纯乙腈，德国默克（Merck）公司;超纯水，实验室自制;桔霉素标准品（纯度99%），美国西格玛（Sigma）公司;植物RNA提取试剂盒，美国Omega Bio-Tek公司;植物基因组DNA提取试剂盒，康为世纪生物技术公司。

菌种保藏培养基：麦芽汁（糖度10～12°Bx），琼脂粉2%;发酵培养基：大米粉5 g，NaNO3 0.3 g，KH2PO4 0.15 g，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，自来水100 mL，pH 7.0;葡萄糖蛋白胨培养基：葡萄糖60 g/L，蛋白胨20 g/L，MgSO4·7H2O 5 g/L，NaNO3 10 g/L， KH2PO4 10 g/L。YES培养基：YES1培养基为酵母浸膏40 g/L、蔗糖160 g/L，YES2培养基为酵母浸粉40 g/L、蔗糖160 g/L，2种培养基成分分别灭菌，灭菌后混匀。以上培养基灭菌条件为121 ℃，15 min。

1.2 仪器设备 回转式恒温调速摇瓶柜（HYG-Ⅱa 型），上海欣蕊自动化设备有限公司;微电脑控制光照培养箱（LRH-250-GⅡ 型），珠江广东省医疗器械厂;立式压力蒸汽灭菌锅（HX05L288 型），上海华线医用核子仪器有限公司;超净工作台（ SW-CJ-1FD 型），上海博讯事业有限公司医疗设备厂;高速冷冻离心机（J-26 XP 型），贝克曼库尔特（中国）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 红曲霉培养条件。

液体发酵：在菌种保藏管中加入3 mL生理盐水制成菌悬液，接种到种子培养基中，30 ℃培养28 h，得到种子液，将孢子浓度调整为106个/mL。在装有50 mL YES培养基的100 mL三角瓶中接种5 mL调好浓度的种子液，置于相应的条件下培养。无菌条件下采集上层菌丝体用于RNA或DNA的提取和测定生物量。發酵液用于桔霉素的测定，大米发酵：将5 mL种子液均匀接种到装有50 g大米培养基的100 mL培养瓶中培养。

1.3.2 样品处理。

1.3.2.1 固体样品。

红曲霉发酵物60 ℃烘干6～8 h至恒重，研钵研磨均匀成粉并过100目筛后准确称取0.500 0 g放置到洁净离心管中，加入75%乙醇3.2 mL，超声30 min，3 000 r/min离心15 min，取出上清液移入容量瓶，再向沉淀中加入75%乙醇3.2 mL ，超声30 min后3 000 r/min离心10 min，再次取出上清液移入容量瓶，重复3次。合并上清液，用75%乙醇定容至10 mL，静置沉淀30 min，取上清经0.45 μm滤膜过滤后备用。

1.3.2.2 液体样品。取0.5 mL红曲发酵液至离心管，加1 mL无水乙醇后混匀，60 ℃水浴60 min，5 000 r/min离心15 min，收集上清液，静置沉淀30 min，取上清0.45 μm滤膜后检测备用。

1.3.3 桔霉素含量测定。

1.3.3.1 实验室快速检测法。

检测条件为色谱柱：Agilent TC-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）;流动相为乙腈∶甲醇∶水=70∶10∶20，配好的混合溶液须放置过夜，用磷酸调pH 2.66～2.68，调好pH后用有机滤膜过滤2次，超声脱气30 min，超声后的流动相在移动过程中需尽量减少晃动以免气泡混入;选择荧光检测器，设置检测波长λex=331 nm，λem=500 nm，开灯预热20 min后进样;柱温25 ℃;流速1 mL/min;进样量20 μL。

1.3.3.2 国标方法。检测条件为色谱柱：Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，粒度5 μm）;流动相为乙腈∶水=35∶65，水用色谱纯磷酸调pH至2.5，乙腈和水分别用有机滤膜过滤2次，超声脱气30 min，超声后的流动相在移动的过程中需尽量减少晃动以免气泡混入;检测器：荧光检测器，检测波长：发射波长（λem）=500 nm，激发波长（λex）=331 nm;柱温28 ℃;流速1 mL/min;进样量20 μL。

1.3.4 红曲霉CS-5桔霉素合成基因的克隆及表达分析。分别用康为世纪生物技术公司植物基因组提取试剂盒和美国Omega Bio-Tek公司 RNA提取试剂盒进行红曲霉CS-5基因组DNA提取和RNA的提取及反转录。

1.3.4.1 红曲霉CS-5基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定。取红曲霉的基因组DNA样品5 μL，用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定基因组DNA的纯度及浓度，具体步骤参考文献[17]。

1.3.4.2 红曲霉CS-5桔霉素合成相关基因克隆、产物纯化及产物回收。

（1）红曲霉桔霉素合成相关基因引物设计。桔霉素合成相关基因序列参考来源：orf1，ctnA，orf3，orf4，orf5（GenBank accession No.AB243687，NCBI），pksCT （GenBank accession No.AB167465，NCBI），ctnD，ctnE，ctnF，ctnG，ctnH，ctnI，ctnR1，orf7 （GenBank accession No.EU309474，NCBI），actin gene （GenBank accession No.AJ417880，NCBI），引物设计软件：Primer-Blast在线软件（NCBI），设计引物见表1、2。

若PCR产物为单一条带，则进行PCR产物纯化;若PCR产物中有杂带，则对目的条带进行切胶回收。若某些基因没有扩增出目的条带，重新设计引物克隆这些基因。

（2）PCR产物纯化。使用康为世纪生物技术公司的DNA产物纯化试剂盒进行PCR产物纯化，按照试剂盒操作说明操作。

（3）PCR产物回收方法。

使用加拿大FERMENTAS公司的膠回收试剂盒对PCR产物进行回收，按照试剂盒操作说明操作。

1.3.4.3 红曲霉CS-5 RNA 的提取及反转录。使用美国Omega Bio-Tek公司 RNA提取试剂盒进行红曲霉CS-5 RNA的提取及反转录，按照试剂盒操作说明操作。

1.3.4.4 Rt-qPCR鉴定红曲霉CS-5桔霉素合成相关基因是否表达。红曲霉桔霉素合成相关基因相对表达量监控采用实时荧光定量PCR法（SYBR Green染色）。扩增程序：95 ℃ 10 min，1个循环;95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。荧光定量PCR的引物设计如表3所示。

2 结果与分析

2.1 红曲霉CS-5不产桔霉素验证

以YES为发酵培养基，培养15 d后取发酵液，分别用快速检测法和国标法2种HPLC方法测定样品中桔霉素含量。应用快速检测法对进样量为浓缩5倍后100 μL的CS-5样品进行检测，未检出桔霉素，HPLC检测结果如图2所示。

采用国标法对进样量为浓缩5倍后CS-5发酵液进行检测，结果如图3所示。

对CS-5发酵液进行以上2种检测方法检测均未检测出桔霉素，可见CS-5为一株不产桔霉素的红曲霉菌株。

2.2 红曲霉CS-5桔霉素合成基因的克隆及表达分析 以不产桔霉素的红曲霉菌株CS-5为研究对象，对已报道的桔霉素合成相关基因簇上14个基因进行克隆及表达分析，从基因组成及表达水平对红曲霉CS-5不产桔霉素的原因进行研究。

2.2.1 DNA克隆结果。

用第一批引物（表1）以CS-5基因组DNA为模板对桔霉素合成相关基因进行克隆，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。图4中，DNA Marker为1 kb plus DNA Ladder。由图4可知，没有扩增出orf1、ctnA、orf3、orf4、orf5、ctnE和ctnG基因（或条带不清晰、杂带）。将扩增出的pksCT、orf7、ctnD、ctnF、ctnH、ctnI和ctnR1基因片段经纯化后，送测序公司测序。测序结果与NCBI上报道的桔霉素合成相关基因序列（GenBank accession No.EU309474）进行Blast比对，结果见表4。

采用第二批引物，对上次试验没有扩增出的orf1、ctnA、orf3、orf4、orf5、ctnE和ctnG基因进行克隆，引物列表见表2（F1，R1），PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示。图5中第1条Marker为1 kb plus DNA Ladder，第2条Marker为DM2000。由图5可知，仍然没有扩增出ctnA基因;扩增出的of5、ctnE和ctnG因为单一条带且大小与目的产物大小一致，将这3个基因进行PCR产物纯化后测序;orf1、orf3和orf4基因虽然有杂带，但图中用方框标出的条带与目的产物大小一致且与杂带相距较远，将这3个条带切胶回收后，送测序公司测序。虽然扩增出的ctnE基因与目的产物大小一致，但测序结果显示与NCBI上报道的ctnE基因序列同源性几乎为0。测序结果见表4。

设计第三批引物，克隆ctnA和ctnE基因引物列表见表2（F2，R2），结果仍然没有扩增出这2个基因。将克隆得到的基因PCR产物经纯化或胶回收后送测序公司测序，结果见表4。

2.2.2 红曲霉CS-5 RNA的提取、反转录及基因表达分析。

红曲霉CS-5 RNA电泳结果见图6。第一泳道为红曲霉CS-5 RNA，第二条泳道为Marker：1 kb plus DNA Ladder。从图6可以看出，红曲霉CS-5 RNA条带清晰，可以进行下一步试验。

将所提RNA反转录成cDNA。以CS-5 cDNA为模板，用表3引物作Rt-qPCR，分析各基因的表达情况，结果如表4所示。

从表4可以看出，采用3批不同引物进行扩增后发现，红曲霉CS-5的基因组DNA中缺少ctnA和ctnE基因（ctnA基因编码锌指转录因子是桔霉素合成途径中的激活基因，ctnE是脱氢酶的编码基因）;克隆得到的红曲霉CS-5 ctnF和ctnH基因与NCBI上报道的ctnF和ctnH基因（ctnF和ctnH基因分别编码变位酶和短链脱氢酶）同源性仅为71%和76%;通过荧光定量PCR的方法进行表达量检测，在红曲霉CS-5基因组DNA中虽然克隆得到orf5基因（编码膜转运蛋白），但该基因不表达。

3 结论

桔霉素残留一直是困扰红曲霉发酵制品的重要安全问题，通过发酵条件优化能够减少但是并不能完全去除桔霉素。通过分析桔霉素合成基因簇中各基因功能发现，基因簇中的各个基因具有协同作用，桔霉素合成并不是单个基因起作用。筛选一株不产桔霉素的红曲霉菌在工业化生产中具有重要的实用意义，同时研究其基因结构有助于了解桔霉素的合成调节机理。

该研究表明，CS-5中orf5基因没有表达，同时ctnA基因缺失。Shimizu等[11]敲除了红曲霉的ctnA基因，结果pksCT和orf5转录大量减少。推测，CS-5中orf5的不表达可能和ctnA的缺失有关。而在CS-5中，虽然没有ctnA基因，但是pksCT基因仍然可以表达，并且没有桔霉素产生。这说明ctnA并不是整个基因簇的唯一激活因子。红曲霉MX-1在蓝光下诱导以后桔霉素合成基因簇表达规律也显示ctnA并不是整个基因簇的唯一激活因子。有研究显示，ctnA敲除后，仍有部分桔霉素产生，而缺少ctnA和ctnE基因的CS-5不产桔霉素，说明，ctnA仅决定桔霉素的产量，并不决定是否产桔霉素。有研究证实，敲除ctnE基因，桔霉素的产量降低，但是仍有桔霉素生成。这说明ctnE也不是决定是否生产桔霉素的原因。真正造成不产桔霉素的原因可能是ctnF和ctnH基因的低同源性，因此ctnF和ctnH基因的同源性也可能是决定红曲霉是否产桔霉素的重要因素。

该研究得出以下结论：虽然CS-5中orf5基因没有表达，同时ctnA基因缺失，但红曲霉CS-5不产桔霉素的主要原因是ctnF和ctnH基因的同源性较低。ctnF和ctnH基因的同源性可以作为筛选不产桔霉素的红曲霉菌株的重要依据。

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基金项目 国家自然科学基金项目（31330059、 31801519）。

作者简介 杨华（1985—），男，河北唐山人，博士，从事发酵食品与微生物资源开发与利用方面的研究。*通信作者，教授，硕士，博士生导师，从事食品生物技术方面的研究。

收稿日期 2020-01-03;修回日期 2020-02-11