山丹丹开放式组织培养抑菌剂的筛选

王凯　蔡晓妮　王延峰

摘要 为简化组培环节，降低组培成本，对开放式组织培养中山丹丹增殖和生根培养基添加次氯酸钠浓度进行筛选。结果显示：添加次氯酸钠浓度为0.013%时，山丹丹增殖系数最高;次氯酸钠浓度为0.016%时，山丹丹生根率最高。最终选择0.014%为山丹丹开放式组织培养的最适浓度。

关键词 开放式组织培养;山丹丹;抑菌剂

中图分类号 Q 943.1文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）23-0140-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.23.034

Selection of Bacteriostatic Agent in Open Tissue Culture of Lilium pumilum

WANG Kai1，2，CAI Xiao-ni3， WANG Yan-feng1，2

（1.College of Life Science， Yanan University， Yanan， Shaanxi 716000;2.Key Laboratory of Chinese Jujube， Yanan， Shaanxi 716000;3.Yanan Zhengda Hong Landscaping Co.， Ltd.， Yanan， Shaanxi 716000）

Abstract In this experiment， the concentration of antibacterial agent （sodium hypochlorite） was selected for the culture medium of proliferation and rooting in open tissue culture of Lilium pumilum. The results showed that when the concentration of sodium hypochlorite was 0.013%， the multiplication coefficient was the highest; when the concentration of sodium hypochlorite was 0.016%， the rooting rate was the highest. Finally， 0.014% was selected as the optimal concentration for open tissue culture of L.pumilum.

Key words Open tissue culture;Lilium pumilum;Bacteriostatic agent

开放式组织培养主要通过添加抑菌剂，摆脱无菌操作环节，在未消毒的自然试验条件中实现的组织培养方式[1]。与传统组织培养不同之处在于，开放式组织培养是在开放未消毒的环境中进行试验操作，省去高压锅和超净工作台等设备，简化组织培养步骤，提高试验效率，降低组培成本。开放式组织培养使用的培养基不通过高压灭菌操作，激素和营养元素损失较少，组培苗品质优良，通过添加抑菌剂实现开放式组织培养的植物有东北红豆杉[2]、香蕉[3]、魔芋[4]等。

山丹丹（Lilium pumilum DC.）为百合科百合属多年生草本植物[5]，其叶狭长，色彩鲜紅，具有观赏价值，是陕北地区极其珍贵的城市园林绿化植物[6-7]，山丹丹同时具有一定的食用和药用价值[8-9]。

筛选次氯酸钠抑菌剂的合适浓度，进行山丹丹开放式组织培养研究，以期降低组培成本，简化组培环节，增加经济效益。

1 材料与方法

1.1 山丹丹开放式组培的初步建立

1.1.1 材料与培养条件。

1.1.1.1 材料。选用山丹丹种球来源于陕西甘泉（109.34°E、36.27°N），选取外形饱满、直径2.5 cm左右、鲜重3.0～3.5 g的健康山丹丹种球。

抑菌剂为次氯酸钠[10]。

1.1.1.2 培养条件。培养室采用LED日光灯照明，28 ℃恒温诱导不定芽萌发，初期暗处理7 d，不定芽萌发后采用1 500～2 000 lx光照，光照周期为8：00—20：00（12 h/d）[11]，湿度保持60%～75%。

1.1.2 方法。

1.1.2.1 开放式组织培养培养基配制。MS培养基（蔗糖、琼脂、 6-BA、 NAA）高压灭菌后调pH至5.8～6.0，待琼脂未凝固前添加一定浓度抑菌剂，分装封口。

1.1.2.2 外植体的消毒与接种。

纯水清洗山丹丹种球，剥取鳞片先用75%乙醇消毒30 s，无菌水清洗5～6次，再用0.1%升汞消毒15 min，无菌水清洗5～6次，最后用75%乙醇消毒30 s，无菌水清洗5～6次[12]。

清洗消毒后切割山丹丹鳞片成1 cm × 1 cm大小，将鳞片内侧凹面向上接种培养，每天观察组织块污染与分化，统计结果。

1.1.2.3 抑菌剂的药效检验。

分别添加浓度为0.001%、0.005%、0.01%、0.05%和0.1%的次氯酸钠进行药效检验。在培养瓶中分别接入4个菌斑（酵母菌和霉菌各2个），每个浓度梯度接5瓶，培养室内光照培养。观察抑菌效果，每3 d观察1次，统计存活率。

存活率=存活菌斑数/接种菌斑数×100%

1.2 山丹丹开放式组培的优化

1.2.1 材料与培养条件。

以开放式组织培养2代成功诱导且长势相对一致的分化芽为材料。培养条件同“1.1.1”。培养过程中，及时清理污染的培养瓶。

1.2.2 方法。

1.2.2.1 培养基制备与接种。培养基制备同“1.1.2”。

1.2.2.2 山丹丹增殖培养最佳次氯酸钠浓度筛选。

将未高温灭菌操作的MS增殖培养基（培养基配方：40 g/L蔗糖、8 g/L琼脂、1 mg/mL 6-BA、0.1 mg/mL NAA）分为7组，分别加入浓度为0.007%、0.009%、0.011%、0.013%、0.015%、0.017%和0.019%的次氯酸钠，在自然开放的环境下，接入“1.1.2”中所得山丹丹鳞片诱导长势相近的丛生芽，每瓶接入3株丛生芽，每组浓度梯度接10瓶，对照组为传统组培经高温灭菌处理，组培室光照培养，连续观察30 d后统计污染率和增殖系数，及时剔除污染组培苗。

污染率=污染瓶数/接种瓶数×100%

增殖系数=增殖芽数/接种芽数×100%

1.2.2.3 山丹丹生根培养最佳次氯酸钠浓度筛选。

将未高温灭菌操作的生根培养基（培养基配方：35 mg/L蔗糖、8 mg/L琼脂和1.0 mg/mL NAA，pH 6.0）分为7组，分别加入浓度为0.006%、0.008%、0.010%、0.012%、0.014%、0.016%和0.018%的次氯酸钠。待山丹丹幼芽长至约4 cm时，取长势好、无根的单株幼芽，以开放的形式接入生根培养基，每瓶接入3株幼芽，每组接20瓶，培养室中光照培养，连续观察30 d后统计污染率和生根率，及时剔除污染组培苗。

污染率=污染瓶数/接种瓶数×100%

生根率=生根芽数/接种芽数×100%

1.3 数据处理 利用 SPSS 16. 0 软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 人工接菌试验抑菌剂有效浓度确定

由表1可知，次氯酸钠对细菌和真菌的抑菌效果明显，次氯酸钠浓度为0.05%时，细菌和真菌的存活率为0。

2.2 山丹丹开放式增殖培养次氯酸钠浓度的优化

由表2可知，污染率与次氯酸钠浓度呈负相关，而增殖系数随着次氯酸钠浓度的增加，出现先升高后降低的趋势;增殖系数最高为3.28，此时次氯酸钠浓度为0.013%，污染率为12.79%;次氯酸钠浓度在0.009%和0.019%时增殖系数差异不显著，当次氯酸钠浓度高于0.013%后，增殖系数降低，这是次氯酸钠浓度越高对山丹丹不定芽毒害作用越大所致。

2.3 山丹丹开放式生根培养次氯酸钠浓度的优化

由表3可知，污染率与次氯酸钠浓度呈负相关，而生根率随着次氯酸钠浓度的增加，出现先升高后降低的趋势，生根数与次氯

酸钠浓度呈负相关;生根率最高为85.7%，此时次氯酸钠浓度为0.016%，污染率为11.7%，生根数为4.48;当次氯酸钠浓度为0.014%时，与传统组织培养的生根数没有显著性差异。选择0.014%为山丹丹增殖和生根培养的最佳抑菌浓度。

2.4 开放式增殖与生根最佳培养基的验证

由表4、图1可以看出，开放式组培的污染率（11.45%）高于传统组培（6.01%）;

3 结论与讨论

该试验对开放式组培过程中山丹丹增殖培养基和生根培养基次氯酸钠最佳抑菌浓度进行筛选，结果可得培养芽的污染率和次氯酸钠浓度呈正相关，而增殖系数和生根率随着次氯酸钠浓度的增加出现先升高后降低的趋势。培养芽的增殖系数最高时，次氯酸钠添加浓度为0.013%，此时污染率略高于传统组织培养;当次氯酸钠浓度为0.016%时，尽管此时的污染率降低，培养芽生长的根数较多，但增殖系数降低，是由于次氯酸钠浓度越高，对山丹丹不定芽毒害作用越大

所致，如再提高抑菌剂浓度，生根数和根长都会受到抑制。为降低不定芽的污染，兼顾生根和增殖，选择0.014%为山丹丹开放式组织培养的最适抑菌浓度。

传统组织培养具有污染率低的优点，但其需要严格的无菌操作和无菌培养环境，消毒过程中易造成培养基营养成分和激素损失，影响后期培养芽的增殖和生长状态，同时无菌操作环节所需仪器设备等投入增加了生产成本，降低了经济效益。开放式组织培养是组织培养的一种改进形式，这种培养需借助抑菌剂抑制培养环境中的微生物生长，在开放未消毒的环境中进行试验操作，省去无菌操作，简化组培环节，降低了生产成本，激素和营养元素损失较少，组培苗品质优良。开放式组织培養的关键在于抑菌剂的使用，

抑菌剂种类和浓度的选择关乎开放式组织培养的成败。该试验选择次氯酸钠作为抑菌剂，筛选合适的使用浓度，为山丹丹的开放式组培奠定了基础，同时也为开放式组织培养中抑菌剂的使用提供了理论依据和选择参考。

参考文献

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基金项目 国家自然科学基金项目（31751005）;陕西省重点研发计划项目 （2018SF-331）;延安市科技局项目（2018CGZH-16）。

作者简介 王凯（1991—），男，陕西安塞人，硕士，从事生物化学与分子生物学研究。*通信作者，教授，博士，从事植物资源研究与利用、植物功能基因组研究。

收稿日期 2020-03-30;修回日期 2020-05-09