两种肺动脉高压模型小鼠的基因表达谱分析

邢书娟，董明清*，杨力侠，罗 颖

(1.西安外事学院 医学院， 陕西 西安 710077； 2.空军军医大学 基础部 病理生理教研室， 陕西 西安 710032)

肺动脉高压(pulmonary artery hypertension, PAH)是一种进行性肺血管疾病，持续肺动脉压升高、血管阻力增加是该疾病的主要特征。PAH形成后很难逆转，最终导致右心功能衰竭和死亡[1]。慢性低氧或者血吸虫病是引起PAH的常见病因[2-3]。目前临床上仍缺乏理想的PAH治疗药物，寻找新的PAH治疗靶点和药物具有重要临床意义[4]。

基因芯片和测序技术为发掘PAH治疗的潜在靶点提供可能[5-6]。本研究建立了低氧性PAH小鼠模型，进行了基因芯片表达谱分析，并与公共基因芯片数据库(gene expression omnibus, GEO)中下载的血吸虫病PAH模型小鼠表达谱芯片数据[7]进行联合分析，以探索PAH发病可能的分子机制，挖掘与PAH相关的关键基因及潜在生物标志物。

1 材料和方法

1.1 自测数据中实验动物的分组

将16只成年雄性C57/BL6小鼠(18～22 g)随机分为2组(常氧、低氧，n=8)，分别在常氧(21% O2)或低氧(10% O2)中饲养4周，方案经空军军医大学动物伦理与使用委员会批准。

1.2 取材

PAH小鼠模型(测定右心室收缩压验证)建立成功后，分别处死各组动物，取肺脏，0.9%氯化钠溶液冲洗肺脏中淤血，切取肺组织，迅速置于液氮中备用。每组随机取3只小鼠肺组织进行芯片检测。

1.3 低氧性肺动脉高压模型小鼠芯片实验操作流程

提取小鼠肺组织总RNA，使用NanoDrop ND-1000超微量分光光度计检测RNA的质量，使用标准变性凝胶电泳评估RNA完整性。本研究采用Arraystar小鼠lncRNA V3.0芯片(由上海康成生物工程有限公司提供)，该芯片能够检测约24 881个编码转录本和35 923个lncRNAs。使用Arraystar RNA Flash Labeling Kit对样品进行标记，通过Agilent SureHyb杂交后的芯片经过洗涤，采用Agilent DNA Microarray Scanner对芯片进行扫描，芯片探针信号值经Agilent Feature Extraction软件(v11.0.1.1)采集，使用Agilent GeneSpring GX v12.1软件对芯片进行标准化，标准化后包含探针原始信号的txt文件导入到GeneSpring GX v12.1软件经Quantile处理，去除低质量探针，得到mRNA表达信息，并对两组样本间差异表达的mRNAs进行GO功能注释和KEGG Pathway分析(通过Fold Change和P-value进行筛选)。

1.4 GSE48936数据获得

GSE48936相关数据从NCBI GEO数据库geohttp://www.ncbi.nlm下载获得。GEO是一个免费的公共数据存储库，包括微阵列数据和高通量测序数据。所下载GSE48936数据是血吸虫病引起的PAH小鼠模型，处理方法是将野生型雌性小鼠腹腔注射疟原虫卵，2周后尾静脉注射疟原虫卵，检测右心室收缩压验证模型构建成功。数据集GSE48936由GPL6424，即利用Affymetrix Mouse Gene 1.0 ST Array获取的表达谱数据。

1.5 自测数据(低氧性肺动脉高压小鼠芯片数据)和GSE48936数据联合分析

GEO2R(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)是一个交互式工具，可用于比较两组样本，识别几乎任何GEO系列中的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)[8]。GEO2R 使用geo query和limmar包[9]对原始数据进行背景校正、标准化及表达值计算。处理后数据经Fold-change(LogFC)和T-test筛选差异基因，将|log(FC)|≥1,且P<0.05的基因定义为差异表达基因。对自测的低氧性PAH小鼠芯片数据和GES48936数据联合分析，发掘共同的差异表达基因，以供后续分析。

1.6 共同差异表达基因的功能富集分析

Metascape是一个在线的、用于基因功能分析的工具，利用Metascape (http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)这一工具，对共同差异表达

基因做GO注释和KEGG通路的富集分析[10]。

1.7 蛋白质相互作用网络(PPI)分析和模块筛选

String数据库是用于分析蛋白质相互作用网络的在线检索工具，本文使用String11.0对两组数据联合分析后的共同差异表达基因进行蛋白相互作用网络整合分析，得到的互作结果利用cytoscape3.7.2建立网络模型，进一步采用MCODE插件对网络模型进行筛选。

2 结果

2.1 自测数据(低氧性肺动脉高压模型)肺组织差异表达基因

低氧性PAH模型小鼠肺组织及正常对照组小鼠肺组织相比，表达差异基因672个,其中上调表达基因295个，下调表达基因377个(图1)。

2.2 GEO数据信息与差异表达基因的鉴定

从GEO数据库下载数据GSE48936，经R包分析得到差异表达基因442个，其中有343个基因上调表达，99个基因下调表达(图1)。

2.3 自测数据(低氧性肺动脉高压小鼠芯片数据)和GSE48936数据联合分析

将GSE48936和自测数据联合分析发现112个共同差异基因，其中87个基因表达上调，25个表达下调(图1)。

2.4 GO和 KEGG 通路富集分析

两组数据中112个共同差异表达基因显著富集到：防御反应、免疫系统过程、免疫应答、刺激反应、炎性反应和胞外基质等生物学过程中(表1)。这些基因的KEGG代谢通路分析结果发现，其主要富集在细胞色素p450对外源物质代谢的影响、趋化因子信号途径、补体与凝血级联、细胞因子及其受体相互作用，药物代谢-细胞色素p450代谢通路中，呈现部分结果(表1)，选取部分做柱状图展示(图2)。

表1 GO和KEGG富集分析部分结果

A.up-regulated differentially expressed genes; B.down-regulated differentially expressed genes; LUO was the self-tested data and GSE48936 was NCBI download data

图2 GO和 KEGG富集结果柱状图Fig 2 Histogram of GO and KEGG enrichment results

2.5 蛋白互作网络(PPI)及模块分析

利用String数据库，对两组数据联合分析得到的112个共同差异表达基因的编码蛋白进行互作网络(PPI)分析，基于互作程度筛选出Cd68、Cd86、Ccl6、Ms4a6d、Cxcl10、C3ar1、Cxcl9、C1qa、C1qb和Ctss10个degree得分较高的hub基因；同时将其蛋白互作网络结果利用Cytosacpe软件中的MCODE进行模块分析，筛选出3个显著(P<0.05)模块，具体如图3。模块1中的基因主要富集到炎性反应、钙介导的信号传导、脂多糖介导的信号通路和白细胞迁移的正调控等生物学过程中。模块2中的基因主要富集到IL-17信号通路、中性粒细胞趋化性和T细胞活化的负调控。模块3中的基因主要富集到骨髓白细胞迁移、炎性反应和防御反应的调节。

3 讨论

PAH一旦形成后很难逆转，最终可导致右心功能衰竭、死亡。大量的动物实验和临床研究表明PAH是一个多环节、多因素参与的复杂病理过程，各种信号通路之间相互作用形成复杂的调控网络。本文利用表达谱芯片技术，对低氧性PAH模型小鼠进行表达谱分析；同时分析GEO数据库中下载的小鼠PAH基因表达谱芯片数据。对本课题组自测数据和NCBI下载数据GSE48936中差异表达基因进行联合分析发现，有112个基因在两组数据中共同差异表达；利用PPI网络分析深入挖掘发现10个degree得分较高的hub基因：Cd68、Cd86、Ccl6、Ms4a6d、Cxcl10、C3ar1、Cxcl9、C1qa、C1qb、Ctss。

表2 蛋白互作网络关系中得分较高的中心基因

Cd68巨噬细胞的减少可导致小鼠性别特异性自发性PAH，巨噬细胞在PAH的发病机制中起着重要的调节作用[11]。Ccl6是非纤毛细支气管Clara细胞分泌于气道中的蛋白，是评估肺上皮完整性的外周标记物，保护呼吸道免受氧化应激和炎性[12]。临床研究发现特发性肺动脉高压患者血清趋化因子配体10(Cxcl10)水平升高，与生存率的提高有关[13]。CTSS(组织蛋白酶S)活性增加有助于肺部炎性反应通过抗菌蛋白的降解，表明该通路可能与囊性纤维化肺疾病的发病有关[14]。

A.module 1; B.module 2; C.module 3图3 共同差异表达的112个基因富集的3个显著模块Fig 3 Three significantly enriched modules of CO-differentially expressed 112 genes

蛋白质互作网络及模块分析结果发现这些基因主要富集到炎性反应、钙介导的信号传导、骨髓白细胞迁移、IL-17信号通路等；炎性反应增加是PAH发病进程中的重要因素之一，此外，报道发现IL-17可能在低氧诱导PAH病理过程中具有重要角色[15]。有趣的是肺血管平滑肌细胞膜上的Ca2+离子通道与低氧性肺动脉高压密切相关。

综上所述，本文通过将自测的低氧PAH小鼠表达谱芯片数据与GEO数据库中的GSE48936芯片数据联合分析，发现112个共同差异表达基因，这些基因富集于免疫反应、炎性反应等生物学过程中，并进一步通过PPI网络分析的方法挖掘出可能与肺动脉高压发生、发展的相关的10个关键基因，这些结果可为阐述PAH的发病机制和开发药物新靶点提供一定参考。