性别差异对苯肼致溶血性贫血小鼠的影响

孙绍华，张 璇，杨曜旗，吕 涛,2*

(1.昆明理工大学 医学院， 云南 昆明 650500； 2.云南省第一人民医院 医学遗传科， 云南 昆明 650032)

溶血性贫血(hemolytic anemia，HA)是指由于某种原因使红细胞(red blood cell，RBC)寿命缩短，破坏增加，超过了机体造血补偿能力时所引起的一类贫血。而应激性红细胞生成(stress erythropoiesis)是指血红蛋白(hemoglobin，HGB)或RBC的减少，机体造血系统的红系造血能力增强，以促进RBC大量生成的过程。研究发现，人类许多疾病的发生率和病死率都表现出明显的性别差异[1-4]，表明了性别差异不仅是激素水平的差异，更是两套不同的生物学系统[5]。目前，性别因素对HA疾病及应激性红细胞生成的影响仍未完全明确。因此，本研究拟通过采用全自动兽用血细胞分析仪检测小鼠外周血指标变化，探讨性别因素对苯肼(phenylhydrazine,PHZ)致HA及其应激性红细胞生成的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级10～11周龄C57BL/6小鼠雌雄各12只，体质量20～28 g(四川成都达硕实验动物有限公司)。

1.1.2 试剂：苯肼(phenylhydrazine，PHZ)(Sigma-Aldrich公司)；采用无菌0.9%氯化钠溶液配制PHZ溶液 (20 g/mL)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分组及处理：分为雄性组和雌性组，每组各12只，均腹腔注射(120 mg/kg)PHZ[6]。

1.2.2 脾脏的采集与测量：前及后第3天完整摘除脾脏，对其进行拍照和脾脏质量称量，计算小鼠脾脏质量/体质量比值。

1.2.3 血液的采集及检测：前第3 天(-3 days)，以及后第3、5、7、9和14天观察小鼠存活状态及体质量变化，采颌下静脉血，每只小鼠每次约采集20～40 μL，收集在EDTA-K2抗凝管中，用全自动兽用血细胞分析仪进行外周血RBC数量、HCT、HGB、白细胞(white blood cell，WBC)数量、淋巴细胞(lymphocyte)数量、单核细胞(monocytes)数量和粒细胞(granulocyte)数量等指标的检测。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 采血方式的改良

对于小鼠外周血采集，传统的尾静脉采血方式存在以下缺点：1)尾巴容易被烫伤；2)尾巴容易被剪伤；3)尾巴容易被刮伤。而本文采用颌下静脉采血方式，利于长期采血，对小鼠损伤较小。实验监测期间，未发生小鼠死亡事件。

2.2 小鼠尿液和脚掌肤色的变化

注射PHZ前，小鼠尿液呈淡黄色，脚掌及脾脏呈粉红色；注射PHZ后第3天，雌性和雄性小鼠均出现HA症状：出现血红蛋白尿(图1A)，脚掌呈淡粉色或苍白色(图3B)，雌雄两组小鼠的这些症状均随着时间的推移而逐渐减弱(第3～14天)。

A.PHZ induced hemoglobinuria on the 3rd day; B.the color of mice paws changes from red to pale 3 days after PHZ injection图1 小鼠尿液和脚掌肤色的变化Fig 1 Effect of PHZ on the urine and paw skin color in female and male mice

2.3 小鼠存活情况及体质量的变化

两组小鼠均无动物死亡。在注射PHZ后第3天，两组小鼠的体质量均显著性降低；其中，雌性体质量减少2.40 g，雄性体质量减少2.96 g。第7天后，两组小鼠体质量均开始逐渐恢复。

2.4 脾脏的变化

注射PHZ后第3天，雌雄两组小鼠脾脏颜色均呈深红色且伴有脾肿大(图2A)；且注射后的雄性小鼠脾脏质量/体质量比要显著大于注射前(P<0.01)，雌性同理(P<0.001)。在注射后第3天，雌性小鼠脾脏质量/体质量比明显高于雄性组小鼠(P<0.05)。

2.5 外周血RBC相关指标的变化

2.5.1 红细胞(RBC)计数: 注射PHZ后第3天，两组小鼠RBC计数均显著下降(P<0.0001)，两组间无差异。第5天后，两组小鼠RBC计数开始缓慢回升；雌性小鼠RBC计数在第9天恢复到初始水平；而雄性在第14天才恢复到初始水平；雌性组小鼠的RBC计数在第9天时显著高于雄性组小鼠(P<0.01)。

2.5.2 红细胞压积(HCT): HCT反映RBC数量在血液中所占的容积比例。注射PHZ后第3天，两组小鼠HCT均显著下降(P<0.01)；但两组小鼠HCT之间无差异；第5天后，两组小鼠HCT均逐渐恢复，且在第9天时有差异(P<0.05)，其他时间的差异无统计学意义。

2.5.3 血红蛋白(HGB)浓度: 注射PHZ后第3天，两组小鼠HGB含量均显著增加(P<0.01)。第7天时，两组小鼠HGB含量均下降到最低值，分别为148.3 g/L和150.8 g/L。第7天后，两组小鼠HGB含量开始缓慢回升；雌性小鼠HGB含量在第9天恢复到初始水平；而雄性小鼠在第14天才恢复到初始水平。雌性小鼠的HGB含量在第9天时显著高于雄性组小鼠(P<0.05)。

A.PHZ caused splenomegaly in mice on the 3rd day; B.it was difference in the ratio of spleen weight and body weight between female and male mice 3 days after PHZ injection; *P<0.01, **P<0.001 compared with before; #P<0.05 compared with male

表1 雌雄两组小鼠由PHZ所致的RBC、HCT和HGB的变化Table 1 Effect of PHZ on RBC, HCT and HGB in female and male n=24)

2.6 外周血白细胞相关指标变化

注射PHZ后1～5 d，雌雄两组小鼠外周血的WBC数量、淋巴细胞数量、单核细胞数量和粒细胞数量均呈明显增加趋势(P<0.05)。第7天后，两组小鼠的WBC数量、淋巴细胞数量、单核细胞数量和粒细胞数量逐渐恢复。在PHZ注射前后各时间点，雌雄两组小鼠之间外周血的WBC数量、淋巴细胞数量、单核细胞数量和粒细胞数量差异无统计学意义(表2)。

3 讨论

长期以来，人们习惯性使用雄性动物进行科学研究，却忽视了种群平衡的重要性[7]。关于HA的发病率和病死率是否存在性别差异，目前仍缺乏系统性研究。本研究发现，雌雄两组小鼠在PHZ作用后第3天均出现相同贫血症状，而且雌雄小鼠外周血RBC总数和HCT最大降低的程度也相同。这些结果表明，性别差异对PHZ所致HA的严重程度和发生率并无影响。而在雌雄小鼠贫血恢复过程中，雌性小鼠外周血RBC总数和HCT在PHZ作用后第9天显著高于雄性；这些结果表明，在小鼠应激性红细胞生成过程中存在性别差异：雌性小鼠应激性红细胞生成速率要强于雄性小鼠。究其原因，可能存在以下两种可能：1)骨髓造血功能存在性别差异。已有研究表明，造血干细胞(hematopoietic stem cell, HSC)存在性别差异。雌性小鼠HSC的雌激素受体表达量和分裂频率要比雄性高[8]；2)髓外造血功能存在性别差异。髓外造血是指在疾病或骨髓代偿功能不足时，肝脏、脾脏、淋巴结恢复胚胎时期造血功能的一种机制。本研究发现，雌性小鼠在PHZ作用后脾脏肿大情况比雄性小鼠明显，这在一定程度上表明，雌性小鼠脾脏髓外造血功能可能强于雄性小鼠。另外，本研究发现，雌雄两组小鼠在外周血WBC数量、淋巴细胞数量、单核细胞数量和粒细胞数量差异无统计学意义。其数量的增加可能是由于骨髓的应激造血功能被激活，引发了大量的多核粒细胞或巨核细胞的产生[9-10]。

综上所述，性别对PHZ所致HA小鼠模型的建立无明显影响；但PHZ引发的应激性红细胞生成过程存在性别差异：雌性小鼠RBC的恢复速率大于雄性小鼠。这个现象是否可以在人类细胞上得到证实，仍有待进一步验证。

表2 雌雄两组小鼠由PHZ所致的WBC、淋巴细胞、单核细胞和粒细胞的数量变化