东港市猪主要寄生虫病流行情况调查

邱吉源

（东港市农业农村发展服务中心，辽宁东港 118300）

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料来源

取自东港市某猪场仔猪拉稀粪便。病猪的中后段空肠有卡他性或局灶性、伪膜性炎症，空肠和回肠黏膜表面有斑点状出血和纤维素性坏死斑块，肠系膜淋巴结水肿性增大。显微镜下观察可见肠绒毛的萎缩、融合，肠隐窝增生、滤泡增生和坏死性肠炎，肠上皮细胞灶性坏死，在绒毛顶端有纤维素性坏死物，并可在上皮细胞内见到大量成熟的裂殖体、裂殖子等内生性阶段虫体。

1.1.2 引物设计

根据 Genbank 上的 Isospora suis 18SrRNA 基因全序列（U97523）设计一对特异性引物，拟扩增产物 1178bp。上游引物 5-ACCCACCTTCTGGTGGTCCTCAGGT-3；下游引物 5-CACGCAAAGTCCTCTAAGAAGTGATA-3。

1.1.3 主要试剂和器材

UNIQ-10 柱式临床样品基因组抽提试剂盒。上海生物工程有限公司，Taq 酶 Takara 公司（大连），PMD18-T Uector Takara 公司（大连），胶回收试剂盒杭州博日科技有限公司，DL2000 Marker BBI公司（美国），移液枪 Eppendorf 公司（德国），生物安全柜 苏净集团安泰公司，UNO II PCR 仪 Biometra 公司（德国），DYY 8C 电泳仪北京六一仪器厂，MiniBis Pro 凝胶成像系统DNR公司（以色列），Percellys 24 多功能样品均质器 Benin Technologies 公司（法国）。

1.2 方法

1.2.1 猪等孢球虫卵囊的收集

取镜检卵囊较多的仔猪粪便 10g 于自来水中混匀，用 60 目粪筛过滤，3000r/10min，弃上清液，沉淀于饱和盐水中漂浮 30min左右，吸取上层液置 2.5%重铬酸钾溶液中。

1.2.2 猪等孢球虫卵囊的纯化

将收集的滤液 3000r/min，离心 10min，弃上清液，加入 10 倍体积清水混匀后3000r/min，再离心 10min。洗涤 3 次后加入 5 倍体积饱和食盐水 3000r/min，离心 10min。表面漂浮的白色物质即是卵囊。经过孢子化检查发现，大部分孢子化卵囊为 4 个子孢子，内含 2 个孢子囊的猪等孢球虫。少数卵囊为 2 个子孢子，内含 4个孢子囊的猪艾美尔球虫。

1.2.3 猪等孢球虫卵囊 DNA 的提取

取研磨好的样品 200μl，加入 200μlDigestion Buffer，混匀；加入 20μlProteinaseK，混匀，55℃保温 30min。加入 200μlBD Buffer，70°C 温育 10min。加入 200μl无水乙醇，混匀。然后加入 UNIQ-10 柱。10000r/min，离心 1min.丢弃废液。加入500μL PW Solution，10000r/min，室温离心 1min。丢弃废液。加入 500μl Wash Solution，10000r/min，室温离心 1min。丢弃废液。室温离心 1min。加入新的 1.5ml 离心管。在柱子中央加入 50μl 60℃预热的 Elution Buffer，放置 5min。10000r/min。提取好的DNA 放于-20℃ 冰箱保存。

1.2.4 特异性试验

应用本引物，对猪球虫 DNA、弓形虫 DNA、大肠杆菌 DNA及附红细胞体DNA 进行 PCR 扩增，验证该引物的特异性。

1.2.5 敏感性实验

将猪等孢球虫进行麦克马斯特计数，计算得猪等孢球虫卵囊为 2×104个 /ml。将卵囊稀释为 2×104个 /ml，1×104个 /ml，8×103个 /ml，5×103个 /ml，2×103个 /ml。

1.2.6 临床样本检查

应用本引物，对镜检虫卵较多的仔猪粪便进行卵囊纯化，然后提取 DNA 进行 PCR 检测。

2 结果

2.1 PCR 扩增结果

将猪球虫提取基因组DNA后用引物进行PCR扩增，经过琼脂糖凝胶电泳后，其大小约1200bp，与预期一致。

2.2 测序结果分析

上述 PCR 产物经上海生工测序，应用 DNAstar 软件，与NCBI 收集的猪球虫序列进行比对，发现序列同源性为 99.7%。经 DNAstar 进行序列分析可以看出 11 种原虫处于 2 个进化枝上。其中测序株，isospora suis、sp.Harbin、ohioensis、orlovi、belli、felis、toxoplasma gondi在第一枝，eimeria porci、scalcra、polita 位于第二枝。第一枝中，同源性都达到97%以上，其中 ohioensis、orlovi、sp.Harbin 与测序株同源性高达 99%以上，与下载序列（U97523）isospora suis 同源性高达 99.7%，说明所扩增序列达到预期要求，该测序株为猪等孢球虫。与第二枝上的艾美尔球虫同源性差距较大，说明等孢球虫和艾美尔球虫同源性较低。

2.3 特异性试验

将提取的猪球虫 DNA 和已知的弓形虫 DNA、大肠杆菌DNA、附红细胞体DNA 用合成的引物进行 PCR 扩增，只有猪球虫 DNA 样品有 1200bp 条带。其他均无条带。

2.4 敏感性试验

经过 PCR 扩增，显示该方法最低可以检测猪等孢球虫卵囊数量为5×103个/ml。

2.5 临床检测

取 10 份仔猪粪便进行镜检和 PCR 扩增，其中阳性粪便均扩增出约 1200bp大小条带。

3 讨论

随着现代养殖方式发生变化，由过去的散养变为现在的集约化养殖，猪球虫的感染率变高，尤其以等孢球虫的危害更为严重。等孢球虫多见于仔猪，可引起仔猪腹泻，体重变轻，严重的甚至引起仔猪粪便带血。

目前国内外对等孢球虫 PCR 研究做的比较少，其中 Johanna Johnson等用 PCR 方法检测猪等孢球虫，B.Ruttkowski等用 PCR方法鉴定艾美尔球虫和猪等孢球虫，我国刘长辉等（2007）建立猪等孢球虫 PCR 诊断方法，姚雷等（2007）建立猪等孢球虫巢式PCR 诊断方法。为本次试验提供了研究方向。

猪粪便中杂质较多，而且有时会出现艾美尔球虫和等孢球虫混合感染的情况。对于猪等孢球虫的鉴定需要经过 4 天孢子化才能确定，需要的时间较长应用本法可以准确判断是否感染猪等孢球虫。该 PCR 检测方法对猪等孢球虫孢子化卵囊和未孢子化卵囊均能扩增出特异性条带，说明可以直接选择新鲜粪便进行 PCR 检测，无需进行孢子化，缩短了检测时间。特异性试验表明，该实验对于其他相关虫体均无交叉反应，说明具有较高的特异性。因为 PCR 方法需要的仪器和试剂费用较高，所以该方法应该作为辅助检测而不能完全代替传统的显微镜检查。

4 结论

通过这次调查发现：猪胃肠道寄生虫调查的 1087 份样品，其中猪蛔虫阳性样品 49 份，阳性率为 4.51%。猪结节虫阳性样品13 份，阳性率为 1.19%，猪类圆线虫阳性样品为 29 份，阳性率为 2.67%，猪鞭虫阳性样品 17 份，阳性率为1.56%。猪球虫阳性样品为 209 份，感染率为 19.23%，猪结肠小袋纤毛虫阳性样品为341 份，感染率为 31.37%。

根据 Genbank 上的 Isospora suis 18SrRNA 基因全序列（U97523）设计 1对特异性引物，建立猪等孢球虫病的 PCR 诊断方法并进行了敏感性和特异性实验。此方法可以快速诊断猪等孢球虫的感染，缩短了孢子化的时间，极大的提高了检测效率。