口蹄疫灭活疫苗生产工艺中新生牛血清的应用进展

张峰宇

（中农威特生物科技股份有限公司，甘肃兰州 730046）

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的偶蹄动物（牛、羊、猪等）一种急性、热性、高度接触性和快速远距离传播的动物传染性疾病，FMD被世界动物卫生组织（OIE）列为A类传染。口蹄疫的发生和流行严重影响了社会经济发展和畜牧业的健康发展，是我国乃至全世界急需控制的重大动物疫病之一。防控口蹄疫的方法有：扑杀、消毒、隔离、强制免疫等，我国采取疫苗免疫和扑杀相结合的综合措施防控口蹄疫，目前接种疫苗已在防控口蹄疫中占主导地位。

口蹄疫疫苗生产工艺包含：原材料检验—培养基配制—种子细胞库细胞保存和复苏—种子细胞制备——中毒库中毒制备（转瓶、悬浮）——生产用病毒制备——病毒液收集——病毒纯化、浓缩——病毒液检验——病毒灭活——灭活病毒检验——疫苗乳化——疫苗分装——疫苗包装——疫苗入成品库——疫苗成品检验——批签发——销售出厂。

细胞培养是疫苗生产工艺中不可或缺的重要环节。血清用做细胞培养中最常见的天然培养基，富含蛋白、脂肪酸、白蛋白、球蛋白、纤维粘连素、多肽、激素、胰岛素、氨基酸、葡萄糖、酮酸及其他微量元素。

1 材料 仪器

1.1 材料

（1）细胞 BHK21细胞F16代，由中农威特生物科技股份有限公司提供。BHK21细胞是1961年3月，科学家从5只不知道性别的新生1日龄叙利亚仓鼠（又名金黄色仓鼠）肾脏分离培养而成，1964年8月，冻存的原代细胞经45代传代培养克隆获得，通过驯化进行悬浮培养，主要用于口蹄疫疫苗和狂犬疫苗的生产。

（2）低血清细胞培养液 由中农威特生物科技股份有限公司提供，其配制及分装方法参考文献。

（3）培养基 北京清大天一生物技术有限公司、宜兴赛尔生物科技有限公司、甘肃建顺生物科技有限公司、

（4）新生牛血清（国内知名生产厂家）：甘肃定西聚信生物工程有限责任公司、内蒙古维克生生物技术股份有限公司、天津迪瑞生物科技有限公司、兰州民海生物工程有限公司。

（5）碳酸氢钠：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司

1.2 仪器设备 小方瓶、三角烧瓶、超净工作台、显微镜、吸管、移液器、离心机、生物反应器、恒温水浴箱、恒温摇床

2 试验方法

2.1 贴壁细胞培养

2.1.1 单一血清培养

分别将甘肃定西聚信生物工程有限责任公司、内蒙古维克生生物技术股份有限公司、天津迪瑞生物科技有限公司、兰州民海生物工程有限公司，四种血清以5%的含量添加至BHK21细胞，在小方瓶中处于相同的培养条件下进行培养传代，显微镜下观察细胞贴壁、细胞倍增、生长形态、分裂、细胞密度及细胞活力。

实验结果显示：不同厂家的新生牛血清在进行BHK21细胞培养工艺中，培养效果都存在一定的差异，细胞活力在74～76%之间，要获得高密度、高细胞活力的细胞，血清来源的筛选和质量控制至关重要。

2.1.2 混合血清培养

甘肃定西聚信生物工程有限责任公司；天津迪瑞生物科技有限公司；内蒙古维克生生物技术股份有限公司；兰州民海生物工程有限公司四种血清按相同的比例1.25%混合和按不同比例（总含量5%）混合，在小方瓶中处于相同的培养条件下培养BHK21细胞，显微镜下观察细胞贴壁、细胞倍增、细胞密度及细胞活力。

实验结果显示：混合血清培养的细胞倍增明显提高，细胞活力在90%以上。

研究结果表明：在相同培养条件和环境下，每种单一血清培养的BHK21细胞形态都比较好，形态没有大的差异，细胞活力75%；而四种混合血清培养的BHK21细胞形态更好，细胞倍增数比单一血清培养更高，细胞活力在90%以上。因此选用优质的混合血清来培养BHK21细胞有优势。

2.2 悬浮细胞培养

2.2.1 低血清培养

BHK21悬浮细胞是一株广泛运用于病毒繁殖，生产各种兽用疫苗的细胞，在口蹄疫灭活疫苗生产工艺中，主要采用低血清悬浮培养工艺进行细胞培养和病毒液制备。

在相同的培养条件下，将国内知名厂家甘肃定西聚信生物工程有限责任公司、内蒙古维克生生物技术股份有限公司、天津迪瑞生物科技有限公司、兰州民海生物工程有限公司，四种不同新生牛血清按不同比例混合后，添加血清含量分别以1%，2%，3%在三角瓶，相同培养条件下在恒温摇床进行悬浮细胞液培养。

结果显示：BHK21悬浮细胞在添加含量1%血清进行悬浮培养时生长密度为2.8%左右，细胞活力为88%左右；BHK21悬浮细胞在添加含2%血清进行悬浮培养时生长密度为4.2%左右，细胞活力为98.3%左右；BHK21悬浮细胞在添加含2%血清进行悬浮培养时生长密度为4.4%左右，细胞活力为98.5%左右。

研究表明使用血清含量为2%以上的低血清进行悬浮细胞培养，其细胞密度、细胞活力均优越于使用血清含量为1%的低血清悬浮细胞培养

2.2.2 无血清培养

无血清培养是在天然合成培养基的基础上，通过添加组分不明确的血清替代物（无血清培养基）进行的细胞培养技术，主要用于生物反应器进行规模化培养。

无血清培养基有无动物来源组分培养基；无动物蛋白培养基；化学组分限定培养基四种。无血清培养基蛋白含量比较高，不利于下游产品的纯化；无动物来源蛋白培养基只适用于少数细胞株的培养，基针对性强，一种无血清培养基只能适合某一类细胞的培养具有一定的应用局限性。无血清培养基由于营养不如血清全面，存在潜在的培养细胞所需的某些营养物质的不足；无血清培养基成本高。

研究表明，无血清培养基培养细胞的适用面较窄，不能适用于所有类型细胞的生长增殖，且容易诱发细胞调亡。

3 结论

口蹄疫灭活疫苗生产工艺中，细胞培养方式历经了帖壁、悬浮，所用血清从单一到混合、血清用量从高浓度血清到低浓度血清，培养基从传统合成培养基到无血清培养基。在整个发展过程中新生血清依然发挥其不可替代的作用。

血清是作为支撑和维持细胞培养必不可少的重要天然培养基。能为细胞生长提供必需的营养物质氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物、纤维粘连素、胎球蛋白、转铁蛋白、多肽、氨基酸、葡萄糖、酮酸及其他微量元素；可为维持细胞指数生长提供激素和各种生长因子：胰岛素、肾上腺激素、类固醇激素、成纤维生长因子、上皮生长因子、血小板生长因子，促生长激素；血清中的多肽可以促进细胞增殖因子数量的增加和纤维细胞生长因子以及神经细胞生长因子的增加；血清中的促接触和伸展因子，保护帖壁培养的细胞不受机械损伤。

血清在促进成纤维细胞生长的同时，抑制表皮细胞的生长；血清中的多胺氧化酶与精胺、亚精胺发生多胺反应行动聚精胺，抑制细胞生长。不同厂家、不同批号的血清质量存在很大差异，难以实现实验操作和生产工艺的标准化；血清的获取困难、价格昂贵、成本高等特点不适于大规模细胞培养。血清厂家的选择，质量的稳定性，血清使用量的最佳比例不仅影响细胞培养和病毒液的生产质量，对于控制和降低生产成本，后续纯化浓缩效果均有较大影响。

4 展望

口蹄疫灭活疫苗生产工艺中，选用血清为最天然的培养基，需进一步研究出血清明确的组分、产生毒性因素和铲除的方法、实现血清质量的稳定性、更优化的血清添加比例，使其能适应于规模化、多样化、自动化的培养技术，降低生产成本，提高细胞培养产率和产物表达率，从而提高疫苗生产质量，生产出具有稳定、安全、均一、有效、经济性能为一体的优质疫苗产品，促进畜牧业的进一步健康发展。