大鼠溃疡性结肠炎中医证候动物模型研究进展

刘金响，史 英，刘海涛，袁敏惠，杜晓泉

(1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2.陕西中医药大学第二附属医院,陕西 咸阳 712000；3.陕西中医药大学第一附属医院,陕西 咸阳 712000)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是世界公认的难治性疾病之一，其临床症状易反复发作，病情严重者，可发展成肠道癌症。在目前的《溃疡性结肠炎的治疗:基于欧洲共识和中国共识》[1]中，推荐的首选治疗药物是美沙拉嗪。该药短期疗效不容置疑，但长期服用，会有较严重的不良反应，降低患者的生活质量，而中医药辨证治疗UC，具有不良反应小、疗效显著的优势。但由于中医证候具有一定的抽象性，基础实验中常难以复制证候模型，导致中医药基础研究陷入瓶颈。为探索UC中医证候的复制方法，遂整理分析现有的中医证候模型复制方法的文献，以供以后的研究者参考。

1 模型复制方法概述

根据《溃疡性结肠炎中医诊疗专家共识意见(2017)》[2]，UC共分为以下7种类型：大肠湿热证、热毒炽盛证、脾虚湿蕴证、寒热错杂证、肝郁脾虚证、脾肾阳虚证、阴血亏虚证。经总结文献发现，现有的研究包括寒热错杂证、肝郁脾虚证、脾肾阳虚证以及脾虚湿困(蕴)证UC动物模型复制方法，且均采用“病证结合”的方式，即分别复制中医证候动物模型、UC动物模型，形成“病证结合”的UC模型。

2 UC模型复制方法

UC的模型复制方法共有5种[3-6]：化学法、免疫法、复合法、基因模型、细菌感染模型。在已有的中医证候UC模型中，以部分化学法和复合法为主要的模型复制方法，模型的具体复制方法[3,7]如下。

2.1 葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS)喂养法 调整DSS浓度、饮用时间，可诱导出急性和慢性两种模型。将大鼠适应性喂养1周后，给予5% DSS溶液喂养7 d，可复制急性UC模型。之后换成双纯水喂养14 d，可转为慢性UC模型。

2.2 乙酸灌肠法 乙酸浓度为3%～8%，需要提前利用冰乙酸配制，灌肠时间无具体限制，可每日灌肠，直至模型复制成功。①大鼠禁食不禁水24 h后，将大鼠麻醉。②用内径为2 mm的聚乙烯管，插入距离肛门8 cm的位置，先用肥皂水灌肠，注入1～3 mL乙酸。使大鼠保持头低脚高的状态，持续30～60 s。③用生理盐水冲洗3次。

2.3 三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS)/乙醇联合灌肠法 TNBS与乙醇按2∶1的容积比进行混合。①大鼠禁食不禁水24 h，然后将大鼠麻醉。②用内径为2 mm的聚乙烯管，插入距离肛门8 cm的位置，灌入配制好的TNBS/乙醇溶液，给药剂量为100～150 mL/kg。③将大鼠保持头低脚高的姿态30～60 s，然后将大鼠放回笼中，保暖至自然苏醒。也可以采用二硝基苯磺酸(dinitrobenzene sulfonic acid，DNBS)替代TNBS。

2.4 UC模型评价指标 UC模型的评价指标主要包括疾病活动指数(disease activity index，DAI)和结肠黏膜损伤指数(colon mucosal damage index, CMDI)，具体评分标准如下。

2.4.1 DAI评分标准 DAI评分标准见文献[8]。①大便性状正常，无粪便隐血时，体质量下降率为0%，计0分；若体质量下降1%～5%，计1分；②大便呈软便，并不成形，粪便隐血阳性，体质量下降5%～10%，计2分；若体质量下降10%～15%，计3分；③腹泻，并可见肉眼血便，计4分。DAI=(体质量减少百分比评分+大便性状评分+隐血或血便评分)/3。

2.4.2 CMDI评分标准 CMDI评分标准见文献[9]。肠黏膜无损伤，计0分；肠黏膜充血、无溃疡，计1分；肠黏膜充血和肠壁增厚，没有溃疡，计2分；肠黏膜一个部位溃疡，不伴肠壁增厚，计3分；肠黏膜可见2个或2个以上溃疡/炎症，计4分；结肠黏膜可见2个或2个以上主要部位的溃疡和炎症，或一个部位溃疡和(或)炎症沿着结肠的长度延伸1 cm，计5分；若肠黏膜损伤沿着结肠的长度延伸2 cm以上，计6分，损伤每增加1 cm，就增加1分，最高记录10分。

3 UC中医证候动物模型复制方法

3.1 脾肾阳虚型UC动物模型复制方法

3.1.1 番泻叶灌胃+肌肉注射氢化可的松+TNBS/乙醇灌肠法 文献[10,14]采用这种方法。首先，大鼠每日用10 mL 番泻叶浸出液灌胃；同时以氢化可的松注射液腹腔注射，每日1次，持续14～28 d。

3.1.2 大黄水煎液灌胃+肌肉注射氢化可的松+TNBS/乙醇灌肠法 文献[15]采用这种方法。先复制脾虚模型。上午给予大鼠2 mL大黄水煎液灌胃，下午予以同容积蒸馏水灌胃，持续14 d。再复制肾阳虚模型。第15天开始，按25 mg/kg的剂量，左右臀部隔日交替注射氢化可的松，持续10 d。

3.1.3 腺嘌呤灌胃+冰番泻叶溶液灌胃法 文献[13,16]采用这种方法。先以腺嘌呤灌胃10 mL/kg，每日灌胃，连续2周。从第3周开始，每日予冰番泻叶溶液10 mL/kg灌胃，连续2周。在每次灌胃后0.5 h，用4 ℃冰水50 mL均匀喷洒大鼠全身，湿润皮毛，然后将大鼠置于电风扇(转速1 400 r/min)前吹干。以上方法在脾肾阳虚模型复制成功后，再通过TNBS灌肠复制UC模型。

3.2 肝郁脾虚型UC动物模型复制方法 肝郁脾虚模型UC复制方法共有2种。其中朱亚珍等[17]采用限食限动法复制肝郁脾虚证模型。先模拟饥饱失常，即束缚大鼠四肢，限制其自由活动, 每次8 h左右, 隔日禁食，持续2周。2周后，用TNBS/乙醇溶液灌肠，复制UC模型。刘喜平等[18]、顾立刚等[19]采用乙酸灌肠+限食限动法复制肝郁脾虚证UC模型。第一步，将大鼠每天不定时放入特制圆形箱内限制活动和饮食，并用胶布束绑大鼠后肢，每天约8 h，持续3周。第二步，3周后用一定浓度醋酸灌肠诱导UC模型，并继续重复第一步操作，叠加导致肝郁脾虚的因素，直至UC模型复制成功。

3.3 脾虚湿困型UC动物模型复制方法 文献[20-24]采用猪油灌胃+强迫游泳法复制脾虚湿困证动物模型。大鼠单日禁食不禁水，并予2 mL的4 ℃纯净水灌胃1次；双日自由饮食,并予2～4 mL精炼猪油灌胃1次；强迫大鼠每日站立于深2 cm的水中8 h,连续20 d。第21天开始，将大鼠禁食不禁水24 h后麻醉，用内径为2 mm左右的聚乙烯管从大鼠肛门插入8 cm,注入5% TNBS+50%乙醇[V(TNBS)∶V(乙醇)=12∶5]0.65～0.8 mL或给予DNBS和乙醇混合溶液(DNBS 30 mg溶解于0.25 mL 50%乙醇中)0.25 mL。再提起大鼠尾巴，捏住肛门，保持头低脚高的状态30～60 s。待其自然苏醒，自由饮食饮水。第2天处死大鼠，取组织用于检测相关指标。

3.4 寒热错杂型UC动物模型复制方法 根据石磊等[12]的研究，寒热错杂型UC模型动物最终无寒证或热证的临床表现，且作者未给出明确的判断标准，模型可能不成功。宋捷民等[25]、周尧等[26]采用寒凉药物灌胃+皮下注射干酵母法复制“寒热错杂”模型。先复制虚寒模型：每天上午以丙硫氧嘧啶灌胃，剂量为100 mg/kg,灌胃30 min后放入4 ℃冰柜中冷冻6 h。下午以知母、石膏水煎液[m(知母)∶m(石膏)=3∶4]4 mL灌胃。第26天起加用番泻叶灌胃，持续3 d。第29天皮下注射20%干酵母混悬液,使大鼠发热。最后才复制UC模型。

3.5 UC中医证候模型评价

3.5.1 脾肾阳虚证 ①大便溏泄，甚则脱肛；②消瘦、食欲下降、体质量降低；③畏寒、弓背、蜷缩聚堆；④神态萎靡，毛色枯槁无光泽；⑤易疲劳乏力、嗜卧。第①～③项为主症，第④～⑤项为兼症，具备两项主症及两项兼症即可认为脾肾阳虚证模型复制成功。

3.5.2 脾虚湿困证 ①倦怠、懒动、蜷缩聚堆；②神态萎靡，毛色枯槁、疏散、竖立，易脱毛；③小便量减少，大便软或溏，浮便率升高，拉尾排便实验呈阳性，排便时可出现肛门红肿，甚至脱肛；④行动缓慢，甚至行走歪斜；⑤体质量不增或增加缓慢明显不及正常组，甚或降低；⑥饮食减少；⑦胃肠胀气明显。①～④项为主症，⑤～⑦项为兼症，出现上述症状中3项主症或2项主症加2项兼症即可认为脾虚湿困证模型复制成功。

3.5.3 肝郁脾虚证 ①一般状态观察:精神萎靡,毛发凌乱,色泽晦暗,喜蜷伏角落,耳尖明显向背部方向靠拢；烦躁,警惕性高,容易激惹,目光焦灼,稍有声响即成防御姿态；对束缚反应剧烈,反抗、撕咬束缚带,嘶叫,极力挣脱；挑逗大鼠表现为明显烦躁、易于被激怒、防御姿态明显；大便稀溏。②旷场实验：运动总距离、中央区停留时间及进入次数明显较少。③高架十字迷宫实验：5 min内进入开放臂、封闭臂的次数、时间明显少于闭合臂。④新环境进食抑制实验：5 min中大鼠进食明显减少。

3.5.4 寒热错杂证 出现毛发无泽、爪甲颜色变浅、体质量下降、大便较软现象。第3周出现大便稀软、弓背蜷缩、爱扎堆、懒动嗜卧、行动迟缓无力、形体消瘦、尾巴变凉、毛发枯槁无华。第4周模型组大鼠上述状态较第3周更甚。第26天起加灌番泻叶后,大便性状改变。

4 讨论

由于不同种属的动物、不同模型复制方法、不同模型复制周期，不同喂养方式的动物模型均对实验结果造成影响[27]。为了尽可能全面地总结中医证型UC模型的复制方法，所纳入的研究中，模型复制周期为14～28 d，所用大鼠种类主要为Wistar大鼠及SD大鼠，其中以Wistar大鼠最多。在大鼠性别选择方面，多为雌雄各半或是雄鼠，雌雄各半鼠更符合临床流行病学特征。所用大鼠体质量为180～220 g。

中西医理论体系中“病”的概念各不相同。而“病证结合”的本质是现代医学的“病”与中医学的“证”相结合[28]。此种模型复制方法虽然同时兼顾了UC的西医病理和中医病机特征，是目前中医证候动物模型复制方法较为合理的一种，但仍不够严谨。目前UC病证结合动物模型复制方法基本分为两种：第一种是先复制UC模型，再复制中医证型模型；第二种是先复制中医证型，再复制UC模型。两种方法均可以一定程度地体现疾病和中医证候的特征。在中医药理论中，可有多个疾病对应现代医学的一种“病”，并且中医理论中疾病和证候本应同时出现，不存在先后顺序。在动物模型复制过程中，仅可复制一部分证候的临床表现，舌象、脉象等重要指征无法在动物模型中体现。

在模型评价指标中，中医证候的辨别需要采集“四诊”资料，动物模型中无法采集舌象、脉象等重要信息，仅以中医证候的临床表现为判定依据，使得中医证候模型的评价标准不够科学和客观。因此，有学者[13，28]提出，在中医证候模型的基础上，依据辨证论治的原则，以经典方药干预，观察实验动物各项指标恢复情况，以“反证”的方法验证动物模型复制是否成功。同时，需引入更加客观的指标，如肝郁脾虚证模型引入了“旷场试验”“高架十字迷宫实验”“新环境进食抑制实验”等，以完善中医证候模型评价标准。

“病证结合”方法复制中医证候动物模型虽然有很多缺陷，但目前仍是较合理的一种模型复制方法，对中医药的基础研究起到重要作用。目前，除了基于“病证结合”原则复制UC的中医证候动物模型之外，尚需继续探索更科学合理的模型复制方法。