肿瘤突变负荷对结直肠癌患者免疫治疗疗效的预测价值

张奥伦, 殷 婷, 张西志

(1. 扬州大学医学院, 江苏 扬州, 225009; 2. 扬州大学附属苏北人民医院 肿瘤科, 江苏 扬州, 225001)

结直肠癌(CRC)位居全球恶性肿瘤发病率第3位(10.2%), 死亡率位居第2位(9.2%)[1]。中国结直肠癌发生率较低，但近年来有升高的趋势[2]。目前, CRC的治疗已经从“外科为主、放化疗为辅”的固有治疗模式转向了精准化、个体化的治疗理念，应运而生的免疫治疗也越来越受到重视。不同于依靠外界干预杀死肿瘤细胞的传统模式，免疫治疗是依靠自身的免疫系统杀死肿瘤细胞。近年来研究[3]发现，肿瘤细胞可通过激活免疫检查点活性，从而逃避免疫系统的监视。免疫检查点抑制剂(ICPI)通过拮抗免疫检查点蛋白，促进T细胞活化，进而产生抗肿瘤免疫效应。免疫检查点抑制剂在多种实体瘤的治疗方面已显示出良好的疗效，且具有不良反应较少、与放化疗无交叉耐药等优势。然而，只有部分接受ICPI治疗的患者能够获得持久的临床疗效[4]。因此，预测治疗反应的可能性将有助于患者对这些药物进行适当的选择。

在接受免疫治疗的结直肠癌患者的血液或肿瘤组织中已发现了各种潜在的生物标志物。程序性死亡蛋白-1配体(PD-L1)通常表达于细胞表面，它将程序性死亡蛋白-1(PD-1)结合在启动的细胞毒性T细胞上，从而抑制细胞介导的攻击，这种配体在肿瘤细胞上的过表达提供了对肿瘤细胞攻击的保护。目前，免疫组化检测PD-L1已广泛应用于筛选结直肠癌免疫治疗可获益的患者。然而，肿瘤组织微环境可干扰PD-L1的表达，且在结直肠癌中PD-L1的表达与免疫治疗的疗效关系并不确切。微卫星不稳定性(MSI)是ICPI反应的一个已确定的生物标志物。然而, MSI-H型结直肠癌患者对ICPI的应答率也是可变的，且肿瘤应答者比无反应者具有更多的体细胞突变和更高的新抗原负荷[5], 表明需要额外的预测生物标志物。肿瘤突变负荷(TMB)是一种新兴的独立生物标志物[6-7], 即检测肿瘤基因编码区的突变总数，可用于分层患者对ICPI的反应可能。研究[8]发现，TMB高表达(TMB-H)肺癌患者中，ICPI组应答率高于TMB低表达(TMB-L)患者，且客观缓解率(ORR)、无进展生存期(PFS)均显著改善，提示高TMB与免疫治疗的疗效呈正相关。本研究对TMB在结直肠癌免疫治疗中的疗效预测价值及其临床应用进行综述。

1 TMB概述

基因突变分为胚系突变和体细胞突变。TMB是指肿瘤细胞基因组中所评估基因的外显子编码区每兆碱基中发生置换、插入、缺失突变的总数。高度突变的肿瘤被认为含有增加的新抗原负荷，使其具有免疫原性，并对免疫治疗有反应[9]。在癌症的发生、发展过程中，由于基因组改变导致细胞功能致病性变化，这一过程被称为“驱动”突变，它导致了肿瘤的发生; 大量的体细胞突变可以产生新抗原，这些新抗原可被患者的免疫系统识别。新抗原的大量产生与对检查点阻断反应的增强相关，被认为是ICPI作用于肿瘤组织的机制[10-12]。研究[13]证实，高突变负荷和肿瘤新表位负荷是结直肠癌免疫活性的主要驱动因素。

Panda A等[14]研究提出，在癌症基因组图谱33种实体癌中, 8种存在突变负荷阈值，该阈值识别出具有免疫检查点激活特征的肿瘤。突变负荷高于阈值(ICAM+)的肿瘤具有如下特征: ① 存在免疫激活，高CD8AmRNA水平、免疫浸润证据以及白细胞中高CD8+T细胞比例; ② 可以上调免疫检查点途径基因表达。对黑色素瘤、肺腺癌和结肠癌等研究分析表明，ICAM+肿瘤患者对免疫检查点治疗有更好的反应。而突变负荷低于阈值的肿瘤(ICAM-)和ICAM+肿瘤具有不同的突变模式和免疫微环境，使用临床测序分析可识别该阈值。

TMB不仅受外源性因素(如受紫外光照射、接触有毒化学物质)的驱动，而且由编码DNA修复机制的基因中的破坏性突变所驱动。Endris V等[15]研究显示，发生DNA错配修复机制缺陷的MSI-H肿瘤的TMB值范围为10～100 Mut/Mb, 同时具有MSI-H及POLE28核酸外切酶结构域突变的癌症TMB值大于100 Mut/Mb, 表明这些DNA修复机制有缺陷的案例可以从检查点抑制剂治疗方案中明显获益。

2 TMB在结直肠癌免疫治疗中的疗效预测及相关研究进展

目前, TMB对MSI-H mCRC的免疫治疗的疗效预测价值已在多项临床研究中得到证实。Schrock AB等[16]收集了经免疫治疗的22例MSI-H mCRC患者的临床资料，用下一代测序(NGS)技术在DNA的0.8～1.1 Mbp上测定TMB, 对疗效和进展时间的潜在生物标志物进行分析。他们通过单因素分析和多变量分析，发现TMB与ORR和PFS的相关性最强(P<0.001)。经统计估计TMB的最佳预测切点在37～41个突变/Mb。13例TMB-H的病例均有疗效，而9例TMB-L中有6例存在病情进展。TMB-H患者的中位PFS随访大于18个月，而TMB-L的中位数PFS为2个月。该研究[16]还在大量MSI-H mCRC人群(821/18 140, 4.5%)中使用NGS评估TMB为37.4个突变/Mb, 与第35百分位点相对应，再一次证实了评估TMB可能有助于在MSI-H mCRC人群中进一步分层ICPI的可能应答者。

Dung T L等[17]探讨了TMB和衍生的新抗原对PD-1阻断剂敏感性的影响，结果证明ICPI治疗的错配修复缺陷型(dMMR)结直肠癌患者显示出更高的免疫相关的ORR和PFS，高于错配修复正常型(pMMR)的结直肠癌患者。他们分析整个外显子的序列发现，与pMMR型相比, dMMR型肿瘤的每个体细胞突变数明显更高。研究[18]表明，较长的PFS与大量的体细胞突变与潜在的突变相关的新抗原有关。由此可见，使用MSI-H/dMMR和TMB作为ICPI的生物标志物的原理是相似的，即存在的DNA突变越多，产生的改变肽就越多，导致新抗原被免疫系统成功识别的可能性就更高。因此, MSI-H/dMMR和具有TMB-H的肿瘤之间存在重叠[19]。

一项纳入6 004例大肠癌的研究[20]用CLIA批准的CGP测序确定MSI和TMB状态。他们根据MSI-H患者TMB分布的90%概率间隔的下限值来定义TMB-H的界值。结果显示, 6 004例CRC患者中有302例(5.0%)观察到MSI-H肿瘤，其中99.7%的病例均为TMB-H (范围6.3～746.9 μt/Mb), 而其余的5 702例病例中, 5 538例(97.1%)为TMB-L(范围0～10.8 mut/Mb)。另外，在5 702例微卫星稳定(MSS)的病例中，有164例(2.9%)被证实为TMB-H (范围为11.7～707.2 μt/Mb), 而且在MSS/TMB-H的病例中也显示出了对PD-1抑制剂的良好反应。结果显示，从ICPI治疗获益的目标人群增加了54%(466人vs. 302人)。由此可见, MSI-H CRC中的TMB普遍升高，但仍然相当多变。

TMB检测可帮助对CRC患者进行重新分类, TMB-H可能反映突变相关新抗原的存在，伴随着肿瘤微环境中淋巴细胞浸润的增加，即使在MSS结直肠癌中也存在这种现象[21]。极突变可导致结直肠癌的MSS表型超突变[22]。Stadler ZK等[23]的一项NGS研究证实，突变负荷增加与MSI相关，但区别于MSI肿瘤具有最高突变负荷的结直肠肿瘤都含有极突变。在Ⅰ～Ⅲ期CRC中，高达50%的MSS肿瘤具有高免疫核心，新抗原负荷升高和/或高免疫核心与较好的生存有关[21, 24]。根据Gong J等[25]研究的CRC病例结论显示，尽管免疫组化确认为pMMR, NGS确认了MSS状态，但TMB高的队列对免疫治疗的临床疗效较好; 高TMB和高突变表型相关分子的存在可以识别对ICPI可能有反应的MSS mCRC患者亚群。可见, TMB检测有效地增加了符合ICPI治疗的患者数量。

此外，研究[26]显示TMB在结直肠癌患者中与化疗结果具有一定相关性。在TMB-L组中，与以奥沙利铂为基础的化疗患者相比，以伊立替康为基础的化疗患者的PFS有所改善(11.9月vs. 6.5月,P<0.001), 而在TMB-H中, 2个治疗队列间没有差异。此项研究提出, TMB-L可能是结直肠癌患者化疗结果的一个预测性生物标志物，但这些结果还需要在更大的研究中进行验证。

3 TMB的应用现状及其局限性

检测TMB的具体方法为对肿瘤组织切片或血液标本进行高通量测序(HTS)。根据最新研究[27]结果，可以使用NGS测定法，用经过验证的算法来可靠地估算TMB, 该算法可查询足够大的外显子集，以替代全外显子组测序。但TMB检测目前仍未广泛应用于临床，主要的因素有: ① 高成本。全基因组、全外显子组测序检测时间长且价格高昂，目前在临床应用较多的是选择性测序，但相比免疫组化法测定MSI及PD-L1, 其消耗成本相对较大。② 不同检测平台标准不一。目前有多家基因检测公司都建立了自己的 TMB检测方案，但是每个公司的基因集合所涵盖的基因不同，设定的阈值不同，因此目前TMB检测的现状无法标准化，这是无法广泛应用于临床最为关键的因素。③ 不同类型肿瘤TMB水平差异大。需要区分不同类型肿瘤的可能致病基因组[28]。Chowell D等[29]指出，由于肿瘤免疫机制及微环境尚在进一步的探索中，且基因突变产物具有免疫原性的差异，仅仅依据TMB的数值可能并不能足以准确预测免疫治疗的疗效，同时还取决于TMB突变的“质量”，即HLA分型。研究[30]报道，富含移码基因突变(碱基插入或缺失)的肿瘤比含有非同义突变的肿瘤更具免疫原性。还有研究[31]提示石蜡包块组织样本与血液样本检测的TMB结果有所偏差。

总之, TMB的检测虽然已从临床研究逐步走向临床应用，但仍面临较多的问题，影响TMB表达的相关因素及如何提高其准确度、灵敏度等都需要进一步的研究。

4 总结与展望

近年来，免疫治疗将结直肠癌的治疗带入了一个精准治疗的时代, PD-1/PD- L1抗体可诱导恶性肿瘤的持久缓解，极大延长了疾病缓解期。然而，免疫治疗在结直肠癌治疗领域的总体有效率并不高，如何筛选优势人群更加迫切。TMB是跨多种肿瘤类型的ICPI治疗结果的最新独立预测因子。某些NGS技术从外显子组的一个子集就能够可靠地评估TMB, 而无需使用全外显子测序，从而有助于在临床采用TMB评估结肠癌患者的免疫治疗疗效。在结直肠癌中，虽然PD-L1和MSI-H/dMMR都已被确立为对结直肠癌患者进行分层的生物标志物，但还是不够完美，在敏感性和特异性方面都存在缺陷。

TMB可以帮助在MSI-H患者人群中进一步筛选，并且可以在MSS/TMB-H的亚组中找到在MSI检测中被遗漏的可能获益的优势人群。虽然PD-L1检测可以预测疗效，但其在结直肠癌患者中的阳性率并不高, TMB检测可以与之相互补充，成为评估结直肠癌患者免疫治疗疗效的更具包容性的生物标志物。TMB可在血液中进行测定，当肿瘤组织不可用或无法获得时, TMB便成为优势生物标志物[32-35]。然而，当前TMB的检测仍然面临着很多挑战，有待更多的前瞻性研究进一步证实。当然，除了肿瘤突变负荷外，关于免疫治疗疗效预测因素的研究还有非常广阔的空间，比如肿瘤微环境中浸润的淋巴细胞数量及种类、外周血循环标志物等，都有希望将更多的合适患者筛选出来接受免疫治疗，从而获得更低的副作用及更久的疗效维持时间。