HIF-1α、BMPs、miRNAs 信号通路在骨关节炎发生中作用机制的研究进展

季强，张君涛，张熙南，孟竹，丛龙彬，李齐

（天津中医药大学第一附属医院，天津）

0 引言

骨关节炎（OA）是最常见的关节炎类型，是一种严重的，迟发性和退行性疾病，其特征是关节软骨退变和滑膜炎症，导致关节僵硬，肿胀，疼痛和活动能力丧失。该病可发生在各个年龄段，且随着年龄的增长，患病率呈上升趋势，并在40-50 岁年龄区间的人群中，OA 患病率更高。OA 作为一种社会疾病，在全球范围内已经成为了日益严重的公共卫生问题。几十年来，OA 被认为是一种磨损性疾病，主要的诱发因素包括负重关节压力增加、关节解剖不协调和关节软骨组织脆弱。如今，由于分子生物学的出现和不断发展，人们对OA 发病机制的认识发生了转变，OA 被重新定义为是一种复杂的多因素疾病[1-2]。近些年来，HIF-1α、BMPs 和microRNAs（miRNAs）三种基因在不同的疾病中被发现，通过其自身调控及对其上下游基因调控，控制着疾病的发展变化，为疾病的治疗方法了提供了新思路，逐渐成为了学者们研究的热点。研究发现，HIF-1α、BMPs 和miRNAs 在OA 中各自有不同的基因表达，并通过介导信号通路完成对OA 软骨的合成或降解，在OA 中发挥着至关重要的作用。文将从HIF-1α、BMPs 和miRNAs 三个方面逐一阐述其在OA 中的表达以及通过介导不同的信号通路在OA 中发挥的作用。

1 低氧诱导因子-1α（the hypoxia inducible factor-1α）在OA 中的作用

1992 年，Semenza 发现存在一种核因子，在缺氧条件下可以调控转录激活人类促红细胞生成素，此核因子为低氧诱导因子-1（HIF-1）[3]。HIF-1 是一种碱性螺旋- 环- 螺旋（bHLH）异二聚体转录因子，可以在低氧或缺氧的状态下被激活，参与诱导细胞凋亡。HIF-1 上调的基因表达与高等生物适应高海拔环境、贫血或伤口愈合过程等低氧条件有关[4]。HIF-1α 作为HIF-1 亚基，最早在1995 年由Semenza 在纯化分析HIF-1 的实验中被发现[5]。HIF-1α 对于软骨发育过程中软骨细胞的存活和生长，以及在健康和病理条件下软骨细胞的能量产生和基质合成，都起到了至关重要的作用[6]。HIF-1α 作为转录因子，在低氧条件下被激活后，通过调节与HIF-1α 的相关基因的遗传多态性在OA 中发挥着作用。HIF-1α 调节系统分为三个阶段：即激活HIF-1α 的基因、与HIF-1α 直接相互作用的蛋白质以及HIF-1α 驱动的基因。每一阶段都存在一些具有多态性的基因或蛋白质受HIF-1α 系统调节，与OA 发生发展密切相关[7]。如白细胞介素-16（IL-16）、单核苷酸、基质金属蛋白酶家族（MMPs）等。

1.1 HIF-1α 调节IL-16 基因增加OA 风险

白细胞介素-16（IL-16）是一种促炎症细胞因子，通过促进细胞因子的分泌在炎症性疾病中发挥关键作用，参与软骨细胞的分解[8]。IL-16 失调与类风湿关节炎密切相关，IL-16 存在于类风湿关节炎的滑膜组织中，具有免疫抑制作用，其抗体能够阻断吞噬细胞的活性[9]。通过研究IL-16 基因单核苷酸多态性（SNP）位点发现，在rs4072111 中，与C/C 基因型相比，C/T 基因型可增加原发性膝骨关节炎的发生风险；且在各种SNP 位点的无条件logistic回归分析显示，与TTC 单倍型相比，TTT 单倍型与原发性膝骨关节炎发生风险增加相关[10-12]。在关节内低氧状态时，关节软骨作为一种低氧组织，可使HIF-1α 持续激活，激活的HIF-1α 调节IL-16 基因SNP，表达出可以增加骨关节炎发病风险的SNP，对关节软骨产生破坏。

1.2 HIF-1αHIF1A 遗传多态性在OA 中的双向作用

HIF-1α 信号通路调节低氧组织如关节软骨中的氧稳态，但因HIF-1α 中的HIF1A 基因遗传多态性变体的存在，其转录活性的效率受到了强烈的影响，并对OA 的发生发展产生不同的作用。 Fernández 等人在研究墨西哥人群中膝关节OA 患者的HIF1A 遗传多态性时发现，与正常人群的对照组相比，OA 患者中的rs11549465 多态性的CC 基因型频率显著增加（P=0.003，OR=5.7），CT 基 因 型 和T 等 位 基 因 型 频 率 降 低（P=0.003，OR=0.2），并且rs11549465 SNP（HIF1A）的存在对关节软骨的丢失起到保护作用[13]。而类似结果在Fernández 的另一组研究中进一步得到证实，在对93 名膝关节OA 患者和150 名健康墨西哥人群的HIF-1α 的22 个HIF1AN 基因的42 个遗传多态性的分析研究中发现，HIF1AN rs11190613 多态性CT 基因型（OR=0.44，95% CI=0.19-1.0，P=0.05）与膝关节OA 的保护有关，且对多种基因型多态性的相互作用进行分析时得出，只有COL2A1 基因和HIF1AN 基因相互作用对OA 有保护作用外，其余的HIF-1α 信号通路的基因-基因相互作用大大增加了OA 的发生风险[14]。OA进展过程中，在其他HIF-1α 基因的遗传多态性介导软骨损害的同时，HIF1A 的部分遗传多态性对软骨起到保护作用，达到了HIF-1α 信号通路在体内组织的稳态。

1.3 HIF-1α 与SOX-9 及软骨胶原表型

关节软骨是一种具有特殊生物力学功能的组织，由软骨细胞和大面积的细胞外基质组成。它由紧密的细胶原纤维（II 型）网状结构组成，嵌入高浓度聚集的蛋白多糖分子溶液中[15]。作为软骨形成的关键转录因子，SOX -9 是II 型胶原（COL2A1）表达的有效激活剂，是关节软骨细胞的表型标志物[16]。SOX-9 与编码软骨基质蛋白II 型胶原的基因Col2A1 共同表达，共同参与软骨的形成[17]。软骨细胞内存在多种胶原表型。在正常的软骨细胞中，最为特征性的表型为II 型胶原表型，是合成软骨的重要成分；却极少有I 型胶原和III 型胶原表型在正常的软骨细胞中。但在OA的软骨中，软骨在修复过程中，会出现软骨细胞去分化，从而表现出I 型胶原和III 型胶原，从而不利于软骨组织的修复[18-20]。在一项研究中，Elise Duval[21]等通过用钴离子隔离模拟缺氧使HIF-1α显性负表达和镉离子抵消缺氧异位表达的互补方法，观察到HIF-1α 通过基因转录水平激活了SOX-9，COL2A1 和聚集蛋白聚糖，诱导了SOX-9，COL2A1 和聚集蛋白聚糖的表达；且同时抑制了COL1A1，COL1A2 和COL3A1 的表达，证实HIF-1α 能够诱导人软骨细胞再分化，并能破坏软骨细胞再生修复过程中去分化，达到了双峰的作用，最终完成软骨的再生与修复。

2 骨形态发生蛋白（BMPs）在OA 中表达

骨形态发生蛋白（BMPs）是转化生长因子β（TGF-β）超家族中的一组生长因子，可有由多种细胞分泌[22]。BMPs 最初被发现是因其具有诱导骨骼和软骨形成的能力，既可以治疗骨缺损和诱导新骨的形成；也可以增强了软骨基质合成，表现出其有修复损伤软骨的能力[24-25]。迄今为止，至少有15 种BMPs 被鉴定出来，而被广泛研究的为BMP-2，BMP-3，BMP-4、BMP-7 和BMP-9[23]。现在认为它们构成了一组关键的形态发生信号，可以协调整个身体的组织结构，且BMPs 信号在病理过程中的许多失调强调了BMPs 信号在生理中的重要功能[26]。

2.1 BMP-2 修复OA 软骨组织

在健康与OA 的关节软骨中，均检测到了BMP-2 mRNA 和蛋白的表达[27]。随着OA 的严重程度，BMP-2 在OA 软骨细胞和软骨中的表达水平升高[28]。此外，在OA 患者血清及滑液中也能够检测到BMP-2 表达，且随着OA 严重程度增加，表达水平增高[29]。功能上，BMP-2 信号传导能够诱导细胞外基质（ECM）蛋白产生和增殖，上调SOX9，II 型胶原（collagen II）和蛋白聚糖的表达以修复软骨。Chang[30]的实验结果表明，在瘦素（leptin）诱导的OA 中，经瘦素刺激的JAK2-ERK1/2 信号传导通路调节STAT3-Ser727 磷酸化，再与组蛋白脱乙酰基酶3（HDAC3）结合共同介导BMP-2 表达，最终调控II 型胶原起到修复软骨作用。Blaney[31]等人利用炎性细胞因子白细胞介素-1（IL-1）诱导出小鼠软骨损伤，在关节注射BMP-2 后发现，随着时间的推移，小鼠软骨细胞分化和增强包括II 型胶原和蛋白多糖在内的软骨细胞外基质（ECM）蛋白表达，被认为BMP-2 对软骨细胞具有再生作用，当阻断内源性BMP 活性时，表现出自体软骨修复功能受损，蛋白多糖合成减少，证实BMP-2 对OA 软骨修复的促进作用。Li[32]等人通过miR-140 控制BMPs 信号通路抑制软骨细胞肥大，间接证明了BMP 在软骨修复方面的作用。Shu[33]等在研究中发现，制备了软骨细胞特异性BMP-2 和BMP-4 基因单敲除（cKO）小鼠和BMP-2、BMP-4 基因双敲除（dKO）小鼠后，BMP-2 和BMP-4双基因的缺失或BMP-2 基因的单独缺失会导致严重的软骨发育不良表型，而BMP-4 基因的单独缺失会产生轻微的软骨表型。dKO 和BMP-2-cKO 小鼠生长板区软骨细胞结构严重紊乱，在软骨细胞增殖、分化和凋亡方面存在严重缺陷。分析研究机制发现，BMP-2 通过下调软骨细胞CDK4 的表达和抑制细胞周期蛋白D1-CDK4 的相互作用来阻止Runx2 的降解。而Runx2 在关节软

骨的发育中发挥着至关重要的作用[34]。

2.2 BMP-7 对OA 软骨的作用

BMP-7 mRNA 和蛋白表达可在未成熟和成熟的关节软骨中检测到。成熟的BMP-7 主要在表层软骨细胞中检测到，而其前体形式主要在深层软骨细胞中检测到[35]。在哺乳动物中，BMP-7的存在形式主要为异源二聚体，在发育过程中主要作为BMP-2 或BMP-4 的异二聚体发挥作用[36]。在BMP-7 介导的信号通路发出信号时，BMP-7 可以与其I 型受体ALK2、ALK3 和ALK6 以及II型受体BMPR2、ACVR2A 和ACVR2B 来诱导SMAD1/5 磷酸化和SMAD 独立信号，以完成基因调节[35,37]。功能上，和BMP-2 相似，BMP-7 信号转导可以增加软骨基质的合成，增加II 型胶原、透明质酸以修复软骨，并能抑制滑膜中IL-1b 的表达从而起到抗炎作用[23]。Hayashi[38]等在兔前交叉韧带切断术后关节内注射BMP-7，观察数周后发现BMP-7 可抑制骨关节炎的进展，且不会导致滑膜纤维化、异位骨或骨赘形成。陈家磊[39]等将载负有BMP-7 的聚乳酸- 羟基乙酸共聚物（BMP-7/PLGA）缓释球分别与软骨分化培养基和骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外培养，结果发现BMP-7/PLGA 缓释球共同培养后，可以增加II 型胶原和糖胺聚糖的表达，并且促进BMSCs 的增殖，提示BMP-7 具有软骨分化的能力。另外一项研究，将BMP-7 加入到软骨分化的ATDC5 细胞、人骨髓干细胞或兔骨膜组织块中。用不同的检测方法检测发现，BMP-7 可以增加 Col2a1、Sox9、糖胺聚糖的表达，维护软骨生成的潜能；并且BMP-7 介导增加了Bapx1/Nkx3.2mRNA 的表达，通过此通路降低了Col10a1、Runx2、碱性磷酸酶（ALP）、金属蛋白酶13（MMP13）的表达，减少了对软骨的降解与破坏，抑制了软骨细胞的肥大[40]。但在Müller[41]的研究中，却得出了BMP-7 可以增加Runx2 和Col10a1 的表达。

2.3 BPM-4、BPM-6 促进软骨的修复

BMP-4 和BMP-6 对软骨生成和形成也有促进作用，二者都通过与I 型受体结合ALK2 和ALK3 信号诱导SMAD1/5 和SMAD独立信号[35,37]。Shi[42]等将转染过BMP-4 基因的兔脂肪源性干细胞（ADSCs）植入PLLGA 支架后，再植入缺损的兔软骨中，结果显示能够显著改善兔关节缺损模型的软骨形成，组织学显示Col2a1、SOX9 和ACAN mRNA 表达上调，Ⅱ型胶原蛋白表达上调，提示BMP-4 可以促进软骨修复与再生。Ryosuke[43]等将BMP-4转染到肌源性干细胞（MDSCs）用于小鼠软骨修复研究中也得到了相似的结果。BMP-6 在正常关节和OA 关节软骨中均表达，并且发现BMP-6 可以刺激正常关节和OA 关节软骨细胞中蛋白多糖（PG）的合成[44]。此外，BMP-6 可促进脂肪间充质细胞向软骨的分化，并促进脂肪间充质细胞蛋白多糖的积累[45]。

3 microRNAs 在OA 中的表达及介导信号通路在OA 中的作用

microRNAs（miRNAs）由一个单链、小的非编码RNA 组成，序列长度为19-23 个核苷酸（存在19-25 个核苷酸的说法[49]）。这些分子通常与靶信使RNA（mRNAs）的3′-非翻译区（3′-UTR）结合，并通过抑制mRNA 翻译和/ 或破坏mRNA 稳定来抑制蛋白质表达[46,47]。miRNAs 通过微调多靶基因的表达对维持细胞功能至关重要[48]，随着miRNAs 的生物学功能的知识正在不断发展，它们已经成为调控细胞分化、细胞周期进展和凋亡等多种生化途径的关键分子[49]。关于miRNAs 在OA 中的表达，诸多学者已进行了研究及整理[47,49-53]。

Cheleschi[54-55]等实验证实，microRNA（miRNA）和脂肪因子（Adipokines）在OA 发病机制中存在复杂的相互作用，miR-34a 和miR-181a 在软骨细胞内通过介导NF-κB 信号通路，刺激内脂素（Visfatin）诱导软骨细胞的凋亡、超氧阴离子的产生（SOD-2、CAT、NRF2 等）以及炎性因子基因的表达（IL-17、TNF-α、MMP-1、MMP-13），降低Col2a1 的表达。而加入miR-34a 和miR-181a 抑制剂后观察，二者均能抑制Visfatin 的作用，减少软骨细胞的凋亡和氧化应激。Luo[56]等研究认为，miR-34a在OA 滑膜组织中表达上调，TGIF2 基因是miR-34a 的一个靶基因，miR-34a 与TGIF2 mRNA 的3’-UTR 相互作用。在体外，上调的miR-34a 可通过调节TGIF2 诱导骨关节炎滑膜细胞凋亡。在另一项miRNA 介导的NF-κB 信号通路中发现，miR-210 靶向死亡受体6（DR6）的3′-UTR 抑制其表达，DR6 是诱导细胞凋亡和NF-κB 活化的重要蛋白，miR-210 通过靶向DR6 进而抑制NF-κB 信号通路，达到减轻OA 作用。此外，miR-210 与NF-κB 抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸（PDTC）在OA 软骨细胞中通过减少p65 的表达和增加IκBα 的水平而抑制NF-κB 的激活，最终起到保护软骨作用[57]。

Makki[58]等通过研究得出，miR-9 与单核细胞趋化蛋白1 诱导蛋白1（MCPIP1）mRNA 的3'-UTR 中的种子序列相互作用，人OA 软骨细胞中，在白介素-1β（IL-1β）的刺激下，miR-9 的过度表达抑制了MCPIP1 mRNA 的翻译，MCPIP1 的表达下降，促进了白介素-6（IL-6）mRNA 和蛋白的表达，进而加速OA 的发展。关于miR-9 介导的其他通路研究中，出现了不同的结果，Jones[48]等研究证实在OA 中，miR-9 表达上调，过度表达的miR-9 降低了IL-1β 诱导的肿瘤坏死因子α（TNF-α）的产生。此外，miR-9过度表达能也减少MMP13 的分泌。

Zhang[59]等发现，MiR-21 在OA 软骨细胞中高表达，并对GDF-5 直接靶向，通过检测分析，miR-21 抑制了野生型（WT）GDF-5-3’-UTR 的荧光素酶活性，通过诱导GDF-5 mRNA 衰变抑制了GDF-5 的表达，促进OA 发病。此外，MiR-21 的过表达也减弱软骨细胞增殖和Ⅱ型胶原、X 型胶原、糖胺聚糖和蛋白聚糖基因在软骨细胞中的表达，并提高了MMP1、MMP2、MMP3 和MMP9 的水平。Li[60]等实验结果表明，miR-16-5p 在OA 软骨细胞中的表达上调，miR-16-5p 是人软骨细胞SMAD3 表达的重要调节因子，miR-16-5p 与SMAD3 mRNA3’-UTR 结合并抑制其表达，SMAD3 水平的降低可导致软骨细胞中ADAMTS 和基质金属蛋白酶（MMPs）表达的上调，加速OA 进展。另外，体外转染的miR-16-5p 也可显著抑制软骨生成标志物（包括aggrecan 和II 型胶原）的mRNA 和蛋白表达，并增加MMP3、MMP9、ADAMTS4 和ADAMTS5 表达水平。Ji[61]等通过对miR-105 相关信号通路研究证实了，OA 软骨细胞中miR-105 的表达下调，其下调与成纤维细胞生长因子2（FGF2）密切相关。FGF2 在OA 软骨退变中促进分解代谢并阻止合成代谢，在OA 中，FGF2 通过向miR-105 启动子募集p65 抑制了miR-105 转录的调控区域，从而减少了miR-105 在人软骨细胞中的表达。体外实验得出，miR-105 可直接通过靶向Runx2 的3’-UTR 抑制其表达。并且模拟miR-105 过表达也抑制了ADAMTS4、ADAMTS5、ADAMTS7 和ADAMTS12 的产生。相反，在使用miR-105 特异性抑制剂（抗miR-105）敲除miR-105 后，Runx2 蛋白表达显著增加，并且伴随着ADAMTS4、ADAMTS5、ADAMTS7 和ADAMTS12 表达的增加，而这些基因加速了软骨的损伤。

此外，Chen[51]等通过基因测序和生物信息学分析，鉴定出OA膝关节软骨细胞中差异表达的基因和miRNA 的潜在调控，发现在OA 膝关节软骨细胞中，存在LRRC15、MARCKS 和EREG 等26个具有miRNA-mRNA 相互作用的基因。并且每个miRNA 的基因调控都在膝关节OA 微环境改变的发病机制中起着重要作用。

4 总结与展望

随着生物分子学的不断进步与发展，人类对于疾病的发病机制也逐渐地趋向于对基因的研究和观察，HIF-1α、BMPs 和microRNAs 等基因不仅在OA 中表达，在其他疾病领域也发挥着举足轻重的作用，已经成为了近几年学者们争相研究的热点。HIF-1α、BMPs 和microRNAs 等基因在OA 微环境内的表达和在发病机制方面被深入研究，为我们在治疗OA 疾病方法上提供了新思路，打开了新视野，并且基因靶向治疗如今也已经应用到了肿瘤和血液疾病中，而基因靶向治疗何时能够在OA 中广泛应用和推广，对此指日可待。