盐酸氨基葡萄糖含量测定研究进展

李 霞，杨海霞，赵国敏，袁晓如

（山东省药学科学院 山东省生物药物重点实验室，山东 济南 250101）

1 分光光度法

分光光度法包括N-甲基葡萄糖胺法（Elson-Morgan法）、Indol-Hcl法、茚三酮法、4-氨基-5-肼基-4H[1,2,4]-三唑-3-硫醇法（AHTT法）和京尼平法。

1.1 N-甲基葡萄糖胺法

用于测定游离的氨基糖，是GAH含量测定的常用方法，其原理是：GAH中的2-甲基葡糖胺在碱性条件下，与乙酰丙酮缩合，生成的色原与对二甲氨基苯甲醛在酸性条件下结合呈红色，在525 nm左右波长处测定吸光度。翟咏红等[4]用该法测定了复方制剂真灵活胶囊中GAH的含量，且另一成分硫酸软骨素对GAH测定无干扰。冯传平[5]用该法测定了氨基葡萄糖枸橼酸钙分散片中GAH的含量，枸橼酸钙与辅料均无干扰。许创伟等[6]由预处理后的虾壳制备几丁质，用盐酸水解得D-GAH，优化水解工艺确定最佳工艺条件：水解盐酸浓度11.7 mol/L，水解温度95 ℃，水解时间4 h，采用紫外分光光度法，在420 nm处测定样品中D-GAH的含量。

1.2 Indol-Hcl法

将过量亚硝酸与氨基己糖反应，脱氨基同时脱水，生成2, 5-己糖酐，与酸性的吲哚乙醇络合生成桔红色产物，在492 nm波长处测定吸光度。王维等[7]用该法测定了GAH的含量，并与Elson-Morgan法进行比较，结果表明Indol-Hcl法重现性较Elson-Morgan法好，且条件易于控制，对于成品的测定，用Indol-Hcl法精度高，但测定含抗坏血酸等杂质的D-GAH时，采用Elson-Morgan法杂质无干扰，精度更高。

1.3 茚三酮法

GAH与茚三酮反应后，溶液呈紫色，在570 nm波长处测定吸光度。Wu 等[8]用该法测定了GAH缓释片中GAH的含量，研究了茚三酮浓度、反应时间、pH值、反应温度、紫色稳定期和葡萄糖胺/茚三酮比对检测结果的影响，优化了测定方法。

1.4 AHTT法

GAH被高碘酸氧化产生甲醛，与AHTT缩合后进一步氧化生成紫色化合物，在550 nm波长处测定吸光度。Abdullah等[9]用该法测定了药品中GAH的含量，在0.02～0.18 μg/ml范围内遵守比尔定律，该法比Elson-Morgan法准确率高70多倍。

1.5 京尼平法

利用京尼平与氨基发生显色反应，在590 nm波长处测定吸光度。何思蓓等[10]用京尼平显色测定GAH含量，结果表明GAH含量测定的检测波长为590 nm，在80 ℃和pH 8～11条件下，反应时间2 h，产物显色性质稳定，该法与Elson-Morgan法无显著差别，可用于实验室简便测定。

分光光度法是测定GAH的常用方法，该法专属性强，灵敏度较高，但操作过程复杂，影响显色的因素较多，重现性较差，操作时注意精密操作以减小误差。

2 色谱法

色谱法包括高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、高效薄层色谱法（HPTLC）、毛细管电泳法、液质联用法和离子色谱法6种方法。

试剂：质量分数为75%的甲氨基阿维菌素苯甲酸盐药粉(湖北荆洪生物科技股份有限公司生产)，溶剂包括甲醇(AR级，上海润捷化学试剂有限公司生产)、二甲基甲酰胺(DMF，上海润捷化学试剂有限公司生产)及醋酸仲丁酯(AR级，上海润捷化学试剂有限公司生产)，乳化剂包括蓖麻油聚氧乙烯醚(BY-125，邢台蓝天精细化工股份有限公司生产)、苯乙基酚聚氧乙烯醚(600号， 邢台蓝天精细化工股份有限公司生产)、有机硅(自制)和7211(自制)．

2.1 HPLC

2.1.1 不经衍生直接测定

2.1.1.1 HPLC-紫外检测法 罗立等[11]用HPLC测定了GAH及其制剂，检测波长为195 nm，氨基柱HPLC普适性、耐用性良好，能将氯离子与GAH完全分离，采用常规的紫外检测器，可满足生产企业现有的检测技术水平。Kosman等[12]采用HPLC，检测波长为 195 nm，考察了在水及不同pH（1.2，4.5和6.8）溶出介质中GAH硫酸软骨素复方片的溶出度。

2.1.1.2 HPLC-二极管阵列检测法 张洁等[13]采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）测定GAH。采用二极管阵列检测器，利用亲水作用较强的色谱柱，避免目标峰周围出现负峰、与杂质峰分离不好和目标物不保留的问题。沈丹丹等[14]采用Phenomenex Luna NH2色谱柱，以磷酸盐缓冲液-乙腈（25:75）为流动相，流速为1.5 ml/min，柱温30 ℃，检测波长195 nm，测定了不同厂家GAH制剂的含量及有关物质。

2.1.1.3 HPLC-蒸发光检测法 宫艳艳等[15]应用HPLC-蒸发光法，测定了保健品中GAH的含量，采用Waters Xbridge Amide柱，蒸发光散射检测器，检测条件为漂移管温度105 ℃，载气N2，压力12.5 bar。王太亮等[16]采用HPLC-蒸发光散射检测法测定了氨糖美辛肠溶胶囊中GAH的含量，采用Inertsil C8色谱柱，以乙腈-水（70:30）为流动相，流速为1.0 ml/min，柱温为25 ℃。杨淮等[17]采用HPLC-蒸发光散射检测法测定了GAH胶囊的含量，使用氨基色谱柱，以乙腈-水（70:30）为流动相，流速为1.0 ml/min。

2.1.1.4 HPLC-示差折光检测法 姜红等[18]用HPLC-示差折光法测定GAH含量，采用NH2色谱柱，以磷酸铵缓冲液-乙腈（45:55）为流动相，流速为0.6 ml/min，为质量标准提高提供参考，适合于GAH类药物的质量控制。

2.1.2 衍生后测定 朱志灵等[19]采用RP-HPLC柱前衍生化法测定壳聚糖喷雾剂中GAH的含量，采用Kromasil C18色谱柱，以乙腈-0.05 %磷酸盐缓冲液为流动相，梯度洗脱，流速为0.6 ml/min，衍生化后产生的两个异构体均达到良好分离。王英瑛等[20]将芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺（FMOC-OSu）加入GAH溶液，在三乙胺存在的碱性条件下进行衍生化反应，衍生后用HPLC在265 nm波长处测定。采用该法测定了原料药、片剂及氨基葡萄糖硫酸钠盐胶囊中GAH含量。Zhu等[21]采用氯甲酸芴甲酯（FMOCCl）对几丁质水解产生的GAH进行衍生化后，用HPLC在254 nm波长处测定了GAH含量，该法还可用于测定原料及食品中几丁质的纯度。王德伟等[22]用RP-HPLC柱前在线衍生法在340 nm波长处测定了保健品中氨基葡萄糖硫酸钾盐的含量，利用邻苯二甲醛衍生试剂与氨基葡萄糖硫酸钾盐中的氨基进行柱前在线衍生化反应，解决了GAH在反相柱上保留时间短，难与杂质分离的缺点。

2.2 GC

李俊等[23]以1-甲基咪唑为溶剂和催化剂，以盐酸羟胺和乙酸酐为肟化和乙酰化试剂，对GAH片进行衍生化，以甘露醇为内标，用衍生化GC测定了GAH的含量。

2.3 HPTLC

Sullivan等[24]将GAH在硅胶板上展开，喷茚三酮后置可见灯下检视，测定了营养品中GAH含量。Esters等[25]将样品在F254硅胶薄层板上展开后，浸入改良香草醛试液中，加热后显棕红色斑点，在415 nm波长处测定了含中草药成分的营养品中GAH含量。

2.4 毛细管电泳法

Qi 等[26]用毛细管电泳法将GAH、氨基半乳糖、N-甲基葡糖胺、N-乙酰氨基葡糖及氨基葡萄糖醛酸等氨基糖分离。分离后的氨基糖经微波消解丹酰化后在214 nm波长处进行在线紫外吸收检测。张佳蕊等[27]建立了毛细管电泳间接紫外检测法测定GAH的含量，背景电解质溶液为60 mmol/L吡啶二羧酸-0.3 mmol/L十六烷基三甲基溴化铵，pH值为12.30。

2.5 液质联用法

张华珺等[28]建立了高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）测定GAH的含量，优化液相色谱条件，选择CAPCELL PAK CR 1:4色谱柱，流动相为乙腈-20 mmol/L乙酸铵溶液（含0.1 %醋酸）=1:1，流速为0.3 ml/min，采用正离子检测，选择反应监测模式进行定性定量。李鹏飞等[29]采用LC-MS/MS测定人血浆中GAH的浓度，色谱柱选用Agilent TCC18，流动相为乙腈-0.01 %氨水，梯度洗脱，多反应监测模式检测。Roda 等[30]将血浆用三氯乙酸沉淀蛋白后，用高效液相色谱-电喷雾离子化质谱联用法（HPLC-ESI-MS）间接测定了人血浆中GAH含量，使用聚合物基质氨基高效液相色谱柱和水-乙腈流动相梯度洗脱，用MS进行检测，使用电喷雾源并采用多反应监测，分别监测葡萄糖胺和内标物。Zhong等[31]也用HPLC-ESI-MS法测定了人血浆中GAH含量，将血浆蛋白质沉淀后，在Inertsil CN-3色谱柱上等度洗脱，采用MS，多反应监测模式下检测，m/z为180/72，将分析时间大大缩短，提高了工作效率。

2.6 离子色谱法

丰航等[32]利用GAH和维生素C的电导性质，采用离子色谱法对其进行分离，借助电导检测器同时进行二者的含量测定。战英等[33]用阴离子色谱法测定了保健食品中的GAH，该法操作简单，灵敏度高，专属性强，准确度及重复性良好，但是测定时色谱柱易受有机物污染，色谱柱耐受性差，可为该产品的质量控制提供参考。

GAH无特征吸收，HPLC直接测定时采用末端吸收处波长或特殊色谱柱，受流动相、仪器稳定性、色谱柱填料稳定性等因素影响较大；采用HPLC-蒸发光检测法、HPLC-示差折光检测法时方法简便、准确、专属性强；采用衍生后HPLC测定，有特征吸收，准确度高，但是衍生操作较繁琐；衍生化GC专属性较好，但衍生化操作步骤繁琐；薄层色谱法及毛细管电泳法操作步骤均较多，影响因素多，操作重复性较差；液质联用法快速、灵敏、高效，适用于低浓度样品的测定。

3 旋光度法

GAH具有光学活性，平面偏振光通过其溶液时，能引起旋光现象，使偏振光的平面向左或向右旋转，即为旋光度。可利用这一性质测定GAH的含量。庄旭琴[34]采用旋光度法测定了GAH片的含量，浓度与旋光度之间有良好线性关系，回收率好。旋光度法灵敏、准确、操作简单，但对温度要求高，需要在特定温度下操作。

4 滴定法

将D-GAH溶于75 %乙醇溶液中，以麝香草酚兰为指示剂，用乙醇钾溶液滴定至终点时，溶液呈亮蓝色，根据乙醇钾消耗体积，计算GAH的含量。陈金东等[35]用该法测定了保健食品中GAH的含量。骆治琼[36]用滴定分析法和分光光度法测定保健食品中D-GAH的含量，对于两种方法的回收率、精密度及检测结果进行对比，结果无显著差异，且能实现自动化检测。滴定法简便、快捷，适于含量较高的样品中GAH的测定测定，使用自动电位滴定仪重复性更好。

5 结语

GAH及其制剂在多个领域得到了广泛应用，其含量测定方法有多种。随着新方法新技术的产生，基于不同的测定原理，GAH的含量测定方法越来越多样，选择GAH含量测定方法时应根据样品的具体特点选择合适的测定方法。