肺孢子菌肺炎诊断方法研究进展

陈杰，彭丽

(重庆医科大学附属第一医院呼吸与危重症医学科，重庆)

0 引言

肺孢子菌肺炎(Pneumocystis pneumonia，PCP)是由耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii，Pj)引起的感染[1]。PCP是艾滋病患者最常见而严重的机会性感染。随着抗病毒治疗和预防治疗的推广，艾滋病患者和PCP的发病率在欧美出现下降[2,3]。随着器官移植和免疫抑制药物使用的增多，PCP在非人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)感染者中也变得常见。HIV感染的PCP患者通常会发展为亚急性病程，非HIV感染的免疫功能低下患者的特征是疾病进展迅速，呼吸衰竭的风险更高，死亡率更高[4]。HIV阴性的PCP患者的临床表现缺乏特异性，早期影像学表现不典型，往往容易被忽视。随着对PCP认识的加深和检测技术的发展，目前分子生物学技术已逐渐应用于PCP诊断，但在我国暂未广泛用于诊断。相对于染色镜检，分子生物学检测方法具有更高的敏感度和特异度，但操作相对复杂。肺孢子菌体外培养困难，目前无常规培养基进行Pj体外培养成功的报道，仅有一个研究发现在气体与液体培养基交界面借助CuFi-8呼吸道上皮细胞可进行Pj培养[5]，但此培养条件要求高，难以在临床开展。本文将对目前国内外PCP的诊断方法进行综述，为临床恰当使用、评价相关诊断技术与模式提供参考。

1 临床诊断

HIV患者中PCP症状的典型三联征包括：亚急性发作的劳累性呼吸困难、干咳以及发热。部分患者还伴有胸闷、消瘦、纳差等表现。其亚急性病程通常可与细菌性肺炎及其他疾病区分开。与HIV-PCP相比较，非HIV感染者PCP的潜伏期更短，且病程进展速度较快[4]。肺部听诊以干性啰音为主，部分患者无啰音[6,7]。实验室检查以低氧血症为主，可伴有不同程度贫血。影像检查对于PCP的临床诊断极为重要。PCP患者在病程早期胸部X线片并无显著变化。HIV-PCP患者胸部计算机断层扫描(Computed Tomography，CT)特征包括磨玻璃影、月牙征、肺气囊征以及混合型，其中以磨玻璃影最为常见。磨玻璃影可表现为弥漫分布型和斑片状融合型，HIV感染者以弥漫分布型多见，非HIV感染者以斑片状融合型多见[8]。因此，在临床上发现患者有呼吸困难、发热及干咳等症状，且胸部CT提示弥漫性病变存在时，首先需排除HIV-PCP可能。PCP的临床诊断应综合患者免疫缺陷状态、临床表现以及典型的影像学表现来进行分析。

2 病原诊断

2.1 染色镜检

肺孢子菌有包囊和滋养体两种形态。包囊是重要的诊断形态，包囊呈圆形，内含有囊内小体(或称子孢子)。呼吸道标本(痰、支气管肺泡灌洗液或肺组织)检出肺孢子菌是PCP诊断的金标准。呼吸道标本通过染色镜检发现特征性的包囊或滋养体为诊断依据，其中支气管肺泡灌洗液染色镜检阳性率最高[9]。常用的染色方法有六胺银染色(Gomori’s methenamine sliver staining，GMS)、吉姆萨染色和Diff-Quik染色。吉姆萨染色法可使肺孢子菌包囊内容物呈现紫红色，但包囊壁无法染色，再通过六胺银染色可使Pj包囊壁呈现棕褐色，两种方法联合可观察到特征性的包囊结构以确诊[10]。有研究发现GMS的敏感性和特异性均为100%，目前使用最广泛的染色方法是GMS[11]，但GMS使用的染色剂保存时间短，使用时需要临时配置。国外目前以Diff-Quik染色应用较多，是在Wright染色基础上改良而来的一种快速染色法，一般在90秒即可完成染色，效果与其他染色相似。用荧光标记的单克隆抗体对呼吸道标本荧光染色后检出率可达75%-95%，国外已经广泛用于临床诊断，但需要精密昂贵的荧光显微镜。染色镜检虽然操作简便，但检出率较低，且与检验者经验和主观判断密切相关。

2.2 分子生物学检测

近年来聚合酶链反应(Polymerasechainreaction，PCR)技术逐渐应用于PCP的诊断。应用PCR技术检测呼吸道标本(痰、支气管肺泡灌洗液、有创操作获得的肺组织等)的Pj特异性核酸片段对于PCP诊断有重要意义。Pj PCR靶基因主要有：内转录间隔区、线粒体大亚基rRNA(MitochondriallargesubunitrRAN，mtLSUrRNA)、二氢叶酸还原酶、二氢叶酸合成酶、主要表面糖蛋白和热休克蛋白70等基因[12-19]。目前一般使用多拷贝的mtLSUrRNA作为靶基因。

目前PCR技术检测肺孢子菌的方法一般分为常规PCR、巢式PCR以及荧光定量PCR。常规PCR检测是临床上广泛使用的方法。Fan等[20]发现PCR诊断的敏感性和特异性分别为98.3%和91.0%。Gupta等[21]用巢氏PCR对基因靶位ITS和mtLSUrRNA进行扩增检测，发现以mtLSUrRNA作为靶位基因的巢氏PCR敏感性及特异性分别可达100%和98.7%，高于以MSG作为靶位的常规PCR。巢氏PCR扩增检测mtLSUrRNA或许可用于早期诊断肺孢子菌感染。近年来有研究者将实时荧光定量PCR与巢氏PCR和常规PCR比较，发现实时荧光定量PCR的敏感性和特异性更高[22-24]。

随着基因测序技术的不断发展，二代基因测序(Next-generation sequencing，NGS)技术应运而生。PCR依赖已知核酸序列，特异性识别靶向基因位点，而NGS不依赖已知核酸序列和培养技术，可以直接检测各种临床样本(血液、支气管肺泡灌洗液、脑脊液等)中未知致病微生物的基因序列[25,26]。目前已被应用于病毒、罕见细菌和真菌的快速鉴定。近年来，该方法已应用于肺孢子菌检测[27]。有研究表明NGS较传统方法及PCR诊断PCP的敏感性更高[27,28,29]。该方法不仅可以用来明确肺孢子菌感染，但也用于多位点序列分类Pj确定菌株利于PCP的流行病学调查[30]。但NGS检测的价格昂贵、数据存储空间大，目前只在少数临床中心开展，大多数在第三方机构进行此项检测。

3 血清学检测

3.1 (1,3)-β-D-葡聚糖 ((1,3)-β-D-glucan, BG)

BG是一种多聚糖成分，存在多种真菌的细胞壁中，也存在于Pj细胞壁中，可作为PCP辅助诊断的一种血清标志物。Salerno等[31]发现BG升高与HIV-PCP相关性好，若以300pg/mL为阳性阈值，其敏感性为91%，特异性为92%。一项荟萃分析表明BG诊断PCP的敏感性为92%～98%，特异性为83%～86%，可考虑作为临床诊断PCP的筛选指标[32]。Damiani等[33]研究发现呼吸道标本PCR检测结果结合恰当的BG阈值能区别Pj定植和PCP。由于其他真菌感染也可引起BG升高，当其呈阳性时，仍需结合其他方法如染色镜检法、PCR或NGS进一步确诊。

3.2 乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)

有研究发现血清LDH在PCP患者中有不同程度的升高[34,35]。多项研究认为血清LDH升高有助于辅助诊断PCP[32,36,37]。Vogel等[38]在HIV感染和非HIV感染人群中进行血清LDH敏感性和特异性的分析，结果表明在HIV-PCP患者中LDH的敏感性和特异性分别为100%、47%，非HIV-PCP感染患者中敏感性和特异性分别为63%、43%，提示在HIV感染人群中，阳性结果支持PCP诊断，在非HIV感染患者中LDH价值不大。同时，LDH升高在其他肺部感染、肿瘤等疾病也可见[39]。血清LDH升高仅能作为PCP的一项辅助诊断手段。

综上所述，PCP已逐渐成为免疫机能低下人群的常见机会性感染，给这一群体的生存质量和生命带来极大的威胁。在传统的临床诊断方法上，建立加入PCR和NGS为主的分子生物学诊断方法，将减少漏诊及误诊，将对本病的早期诊断和治疗以及预后产生积极的作用。