假基因在子宫内膜癌中的研究进展

张靖羚，周留林

蚌埠医学院附属泰兴市人民医院妇科，江苏 泰州225400

假基因是与编码基因序列高度同源的非编码基因，失去了原有功能的基因拷贝。长期以来，假基因一直被认为是“垃圾DNA”，是进化过程中不可避免的结果[1]。然而，近年来的研究表明，这种对假基因性质的理解并不完全正确，许多假基因具有重要的遗传功能。子宫内膜癌是一种发生于女性子宫内膜上皮，严重影响女性身体健康的恶性肿瘤之一，据统计，子宫内膜癌在世界范围内的发病率正在上升，并且逐渐趋于年轻化[2]。子宫内膜癌好发于50岁以上的妇女，以来源于子宫内膜腺体的腺癌为主，可以分为雌激素依赖型和非雌激素依赖型，前者较为多见[3]。目前主要的治疗方法为手术、放疗和药物（化学药物及激素）治疗。然而子宫内膜癌的发病机制尚不十分明确，给治疗带来了极大的挑战。近些年来许多学者试图从分子水平探索其发病机制、转移路径、靶向治疗，希望实施精准的个体化治疗方案，因此对于假基因在子宫内膜癌中的研究成为热点。

假基因最初源于对非洲爪蟾基因组的研究。1977年，Jacq等[4]在克隆非洲爪蟾DNA中编码核糖体大亚基组分之一的5'端，发现其中存在16 bp的缺失和14 bp的错配，但没有检测出相应mRNA分子的截短5S rRNA相关基因。随后在包括细菌、植物、昆虫和脊椎动物[5-7]在内的多种生命形式中都发现了假基因。根据最新的HUGO基因命名委员会（Hugo Gene Nomenclature Committee，HGNC）统计[8]，有超过13 000个带注释的假基因，随着基因检测技术的进步，这个数量将不断增加。由于假基因与其亲本基因有高度的同源性，所以它们长期以来一直被认为是无功能的，并被认为是中性进化的[9]，经常被用于校准分子进化中各种模型的参数。但是在许多肿瘤疾病中，包括子宫内膜癌，假基因可通过调控相关基因，在转录组学水平上影响肿瘤的发生、发展及侵袭、转移。本综述主要讨论了基因组中假基因的分类和进化方式、假基因的识别、子宫内膜癌相关假基因及其调控基因表达的机制。

1 假基因的分类和进化

假基因以两种方式产生[10]：通过逆转录以及通过基因组DNA复制。根据其原始结构的不同可以分为未加工型假基因和加工型假基因[11]。未加工型假基因包含内含子，又可以分为复制型假基因和单一型假基因。复制型假基因是在不对等杂交时，重复基因的反复拷贝可以使它更快失去原本的功能，单一型假基因是通过单个基因的有害突变产生，所以在基因组中没有同源基因。加工型假基因没有内含子，主要由逆转录产生[12]，会表现出更高的丰度，与单一型假基因相比，它在人类基因组中占更大的比例。Liu等[13]通过研究发现加工过的假基因一旦在基因组中出现，就会逐渐向低GC含量、强二核苷酸偏倚、转录因子结合基序减少、形成核小体的能力降低等方面进化。

2 假基因的识别

由于假基因失去了原本亲本基因的功能，意味着它可能不再具有编码能力，但是仍然与其亲本基因具有高度相似性，因此有必要制定鉴别假基因的标准，消除在功能基因组学框架内进行的研究中可能出现的假基因。目前大多数通过假基因的同源序列对原基因的潜在功能进行评估[14]，主要通过比对基因的核苷酸序列、转录序列或编码的蛋白质氨基酸序列。尽管假基因与基因之间存在显著的相似性，但假基因通常携带多种功能障碍标记，如移码突变、过早终止密码子、改变翻译起始位点或剪接位点的突变、缺失启动子或转录终止子等。根据上述标记的存在，与某些特定基因同源的DNA序列可被识别为假基因。这种方法的缺点是有些假基因可能缺乏这种明确的标记。近年来，Johnson等[15]创建了一个应用程序搜索序列同源性、微小RNA（microRNA，miRNA）表达、假基因表达和基因本体的整合功能关系，用于识别和可视化与癌症基因组图谱中的假基因相关的数千种潜在调控关系。

3 与子宫内膜癌有关的假基因

研究发现假基因具有以下这几种功能：①通过过表达降低亲本基因mRNA的稳定性，调控亲本基因的表达。如常作为子宫内膜癌诊断标志物的肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kinase，MYLK）基因的假基因MYLKP1转录产生一种非编码RNA，抑制其亲本基因MYLK的mRNA表达[16]。②产生小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），通过RNA干涉途径调控基因的表达，达到内源性siRNA的作用。③反转录功能：Hawkins和Morris[17]研究发现若假基因八聚体结合转录因子4假基因5（octamer binding transcription factor-4 pseudogene 5，OCT4-PG5）的反义被抑制时，OCT4及其假基因OCT4-PG4、OCT4-PG5的表达量则会增加，由此说明与亲本基因序列高度同源的假基因可以通过反义转录调控其表达。④作为miRNA的诱饵[19]，假基因可以与它们的亲本基因竞争与miRNA结合，从而调节其同源miRNA对功能基因的抑制。例如，张力蛋白同源第10染色体丢失的磷酸酶基因（gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN）的假基因是一种重要的肿瘤抑制基因，它通过这一机制调控其亲本基因的表达。来自假基因PTENP1的mRNA 3'UTR充当了抑制亲本基因miRNA的诱饵[18]。⑤编码短肽或具有功能的蛋白质。此外，Han等[19]使用新开发的计算通道，从癌症基因组图谱RNA-seq数据中生成了来自7种癌症类型的2808例患者样本的假基因表达谱。研究分析显示，在已建立的肿瘤亚型中有大量的假基因差异表达，仅假基因表达就可以准确地对子宫内膜癌的主要组织学亚型进行分类。

3.1 假基因PTENP 1与子宫内膜癌

PTEN基因是子宫内膜癌中最常见的改变基因，也是目前子宫内膜癌研究中最常见的抑癌基因。它的突变与子宫内膜癌细胞的生长、增殖、迁移及凋亡有关。PTENP1和PTEN两者之间的序列同源性为97.8%，CpG岛921 bp区同源性为91%，是由于PTENP1序列发生18次错配，其中的一次错配引发了蛋氨酸密码子的错义突变，导致起始密码子消除，所以PTENP1不具有编码蛋白的能力[20]。PTENP1是肿瘤抑制因子PTEN的假基因。有研究发现，PTENP1可通过调节PTEN的表达在子宫内膜癌中发挥作用[21]。Ioffe等[22]研究发现PTENP1的转录水平总体低于PTEN水平，二者表达呈正相关。PTENP1可能在基因的多个水平对PTEN发挥调控作用，进而发挥肿瘤抑制作用，预测了miRNA-21、miRNA-19b、miRNA-26a和 miRNA-20a可作为抑制调控因子。Per等[23]研究发现PTENP1可转录形成3个长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA），用于调节PTEN的转录和PTENmRNA的稳定性，其中包括一个正义RNA（sense RNA，sRNA）和两个反义RNA（antisense RNA，as-RNA），转录发生在两个相反的重叠启动子上，由此产生的转录本具有重要的调控功能，sRNA在细胞中表现出竞争性的内源性RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）特性。位于假基因sRNA上的miRNA结合位点（microRNA response element，MRE）与PTENmRNA竞争特异性miRNA，从而阻止了其对PTENmRNA易位的抑制作用。asRNA有两种亚型，其中β亚型与sRNA的功能类似，通过与RNA之间的配对提高了PTENP1的稳定性和miRNA的海绵吸附作用影响PTEN蛋白的生成。相反，α亚型定位于PTEN的启动子，通过招募DNA甲基转移酶3a（DNA methyl transferase 3a，DNMT3a）和组蛋白甲基化转移酶2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）负向调控PTEN的转录。asRNA调控网络的中断会诱导细胞周期阻滞，从而使细胞对阿霉素敏感，这说明了PTENP1表达的asRNA具有生物学功能。

3.2 PTEN和假基因PTENP 1的DNA甲基化与子宫内膜癌

Salvesen等[24]研究138例子宫内膜癌患者的PTEN甲基化状态。其中26例（19%）存在PTEN启动子甲基化，并发现DNA甲基化与肿瘤转移存在显著相关。由此认为，子宫内膜癌中普遍存在PTEN甲基化现象，并且PTEN基因的甲基化与子宫内膜癌晚期肿瘤转移有关，并在肿瘤进展中起重要作用。Ghazanfari等[25]对28例子宫内膜癌患者采用甲基化特异性聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）对PTEN基因的启动子甲基化区域进行分析，结果发现PTEN基因启动子甲基化的频率在肿瘤组织和血液中分别为28.57%和11.54%。说明DNA甲基化缺陷是子宫内膜癌发生的重要因素，PTEN启动子高甲基化可能是子宫内膜癌发生的危险因素。Kovalenko等[26]研究抑癌基因PTEN最小的启动子及其假基因PTENP1的5'序列在子宫内膜癌和子宫内膜增生中的甲基化状态，分析了两个位点，一个位于PTEN基因的最小启动子上，另一个在ATG密码子附近。结果发现，PTEN基因的DNA未发生甲基化，但是超过50%的子宫内膜癌和子宫内膜增生组织中PTENP1区域甲基化，可能是因为没有考虑到该基因及其假基因PTENP1之间的高度同源性，假基因不能正常表达PTEN的功能，所以不能反映真正的PTEN基因改变。PTENP1基因序列的甲基化可以抑制miRNA参与的PTEN转录过程。如果假基因序列的甲基化可以抑制其转录，根据ceRNA的理论，可能伴随着RNA干扰机制对PTEN基因表达的抑制。因此，PTENP1异常转录抑制可能在子宫内膜癌的发病机制中发挥作用。2018年，Kovalenko等[27]进一步研究PTEN基因及其假基因PTENP1的甲基化模式，选取正常子宫内膜组织以及不同年龄阶段的子宫内膜癌组织和血液样本。结果发现所有被分析的DNA样本中都没有携带甲基化的PTEN基因。相反，除了外周血外，PTENP1在所有分析组织中均被甲基化，且甲基化率较高，PTENP1甲基化率在年轻女性和中老年女性中存在显著差异，但是与子宫内膜病变没有直接关系。

3.3 假基因OCT 4-PG 5与子宫内膜癌

转录因子OCT4[28]是POU家族的成员之一，定位于人类染色体6p21.3，包含5个外显子，属于POU转录因子家族中第Ⅴ亚族。POU是DNA结合蛋白，通过结合目的基因八聚体基序激活或抑制下游靶基因，进行基因调控。它是维持胚胎干细胞自我更新的一个重要调节因子，在胚胎发育过程中参与多向性分化的调节[29]。有研究发现，OCT4-PG5是子宫内膜癌中表达量最高的OCT4假基因，且OCT4-PG5的过度表达增强了细胞中OCT4-磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，也称AKT）-细胞周期蛋白D1（cyclin D1）信号通路从而促进子宫内膜癌细胞增殖。此外，miRNA-145模拟物下调OCT4的表达，而过表达OCT4-PG5可以激活OCT4-PI3K/AKT-cyclin D1信号通路并恢复OCT4的表达。OCT4-PG5可以作为“miRNA海绵”吸附miRNA-145，减少其对OCT4转录的抑制作用。

3.4 阿片样生长因子受体假基因 1与子宫内膜癌

Lv等[30]通过研究48例确诊的子宫内膜癌患者的子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织发现GFRP1在子宫内膜癌组织和细胞中均表达上调，并且发现其可以通过负调控miRNA-124-3p抑制阿片样生长因子受体假基因1（opiod growth receptor pseudogene 1，OGFRP1）的表达，从而抑制了子宫内膜癌细胞系Ishikawa细胞的恶性行为，如抑制细胞活力、促进细胞凋亡、抑制细胞迁移和侵袭。此外，去乙酰化酶1（sirtuin1，SIRT1）是miRNA-124-3p的靶基因，miRNA-124-3p通过SIRT1的下游信号调控肿瘤的生长和转移。OGFRP1的失调可以通过调节 miRNA-124-3p/SIRT1 轴，激活 PI3K/AKT/糖原合成激酶 3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β）通路促进子宫内膜癌的发展。

4 小结与展望

目前对于假基因在子宫内膜癌中的研究还处于早期阶段，研究与子宫内膜癌相关的假基因还较少。在这方面，从基因库中进行全基因组范围的功能筛选将为假基因表达和功能提供一个全面的视角。对这些假基因特性的研究将有助于更好地理解假基因及其在子宫内膜癌中可能存在的作用，为假基因作为子宫内膜癌的新生物标志物或治疗靶点提供新的方向。