环状RNA在恶性肿瘤中的研究进展△

曹萱，张徐，蒋鹏程

1江苏大学附属人民医院普外科，江苏 镇江212002

2江苏大学医学院，江苏 镇江212000

1 circRNA概述

20世纪70年代，环状RNA（circular RNA，circRNA）被Sanger等[1]在植物病毒中发现，是一种5'端和3'端首尾连接的闭合环状RNA。然而，受当时技术的限制，研究者们普遍认为circRNA是由于拼接错误产生的[2]。因此，circRNA未引起人们的重视。随着生物信息学和RNA-seq技术的发展，circRNA被证明大量存在于生物体内，且具有稳定、保守、定位特异、表达特异等特性。circRNA根据来源可分为3种类型，包括外显子circRNA（exonic circRNA，ecircRNA）、环状内含子RNA（circular intronic RNA，ciRNA）和外显子-内含子circRNA（extron-intron circRNA，EIciRNA）[3]。目前认为ecircRNA的形成有三种假说模型：套索驱动的环化、内含子配对驱动的环化和RNA结合蛋白介导的环化[4]。

2 circRNA与恶性肿瘤的关系

恶性肿瘤区别于良性肿瘤，其最大的特点是不受约束地生长、扩散并浸润周围组织。全球恶性肿瘤的发病率和病死率均较高，严重影响人类健康。据统计，目前，中国恶性肿瘤的发病率为285.83/10万，病死率为170.15/10万，排名前10位的常见恶性肿瘤依次为肺癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、甲状腺癌和脑瘤[5]。恶性肿瘤病死率高的部分原因是患者症状不明显而无法进行及时、早期的诊断，导致病情恶化，错失最佳治疗时机。若能尽早诊断并进行有效治疗，则可以避免恶性肿瘤的进一步发展，提高生存率。然而，现有的影像学、内镜等检查手段存在一定局限性，因此尽快寻找新的肿瘤标志物应用于恶性肿瘤的临床诊断至关重要。有研究发现，circRNA在肿瘤组织与正常组织中的表达量存在差异[6]，这就意味着circRNA有望成为新的肿瘤生物标志物用于指导临床诊断。另外，研究还发现，circRNA可以充当miRNA分子海绵或竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）进而调控靶基因的表达，与RNA结合蛋白（RNA-binding protein，RBP）结合从而调节特定蛋白的表达，参与蛋白翻译等生物学功能，间接参与恶性肿瘤的发生、发展。例如，circTP63竞争性地与miRNA-873-3p结合，降低叉头盒转录因子M1（forkhead box M1，FOXM1）水平，从而上调着丝粒蛋白A（centromere protein A，CENPA）和着丝粒蛋白B（centromere protein B，CENPB）的表达，最终促进细胞周期进程[7]。c-myc与circ-Amotl1的结合能力最强，circ-Amotl1通过诱导c-myc入核增加致瘤性[8]。LINC-PINT作为一种circRNA，可编码长度为87个氨基酸的蛋白质PINT87aa，在体外和体内均能抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖[9]。因此，可以依据这些功能通过对circRNA进行干预从而实现对恶性肿瘤的抑制。

2.1 circRNA与肺癌

肺癌在全球的发病率和病死率均最高[10]。据统计，中国肺癌的新发病例约为78.7万例，发病率为57.26/10万[5]。Han等[11]发现，circ-BANP在肺癌组织中呈高表达，且与肺癌患者的低生存率有关。circ-BANP作为miRNA-503的ceRNA，与其结合后可导致La相关蛋白1（La-related protein 1，LARP1）的表达上调，从而促进肺癌的生长、迁移和侵袭。hsa_circ_100395过表达可显著抑制肺癌细胞的增殖，通过阻滞细胞周期进程降低肺癌细胞的迁移和侵袭能力；此外，还发现hsa_circ_100395作为ceRNA能够抑制miRNA-1228的表达，促进转录因子 21（transcription factor 21，TCF21）的表达，从而调控肺癌的发展[12]。有研究证实，circ_0001649在非小细胞肺癌组织和细胞中的表达水平降低，且与TNM分期、淋巴结转移情况和预后不良有关[13]。Ding等[14]等发现circ_001569高表达肺癌患者的预后较差，这提示其可作为肺癌的一种预后预测指标。

2.2 circRNA与消化道肿瘤

2.2.1 circRNA与食管癌每年新诊断的食管癌病例数超过48万例，其已成为全球第八大常见的恶性肿瘤死亡原因，在中国的发病率较高，为17.87/10万[5,15]。食管鳞状细胞癌是食管癌最常见的病理类型。Xia等[16]发现hsa_circ_0067934在食管鳞状细胞癌中的表达上调；敲减实验证明hsa_circ_0067934可阻止细胞周期的进展并影响食管鳞状细胞癌细胞的增殖和迁移。很多食管癌患者于确诊前已发生转移，需术前进行新辅助治疗。然而，食管鳞状细胞癌细胞存在抗辐射性。Liu等[17]对食管癌细胞KYSE-150和耐辐射的食管癌细胞KYSE-150R进行了比较，发现沉默circRNA_100367可降低KYSE-150R细胞的增殖和迁移能力。circRNA_100367与miRNA-217结合后，miRNA-217以Wnt3为靶点，增强了KYSE-150R的抗辐射性。这些研究为食管癌的生物治疗提供新的思路。Fan等[18]检测到hsa_circ_0001946在食管鳞状细胞癌患者血浆中的表达水平均低于健康者；通过受试者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析发现，ROC曲线下面积、灵敏度和特异度分别为0.894、92%和80%；hsa_circ_0001946的表达水平与食管鳞状细胞癌的复发率有关。Hu等[19]发现circGSK3β的表达水平与食管癌的临床分期及预后不良均呈正相关。以上研究结果表明circRNA具有作为临床诊断和预后预测指标的潜在价值。

2.2.2 circRNA与胃癌胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤，东亚国家是其高发地区，特别是日本和中国[20]。胃癌的发生、发展是一个复杂的过程，加之癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖类抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）、糖类抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）、甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）在早期胃癌中的阳性率较低[21]，且部分患者的症状不明显，未引起重视，忽略了胃镜检查。Zhang等[22]研究发现，circRNA_100269可预测胃癌的复发，进一步探究发现circRNA_100269在非肿瘤组织中呈高表达，在胃癌组织中呈低表达。通过Target-scan和Miranda在生物信息学数据库中搜索circRNA_100269的潜在靶点，进一步揭示miRNA-630与circRNA_100269的表达水平呈负相关，二者相互作用能够抑制胃癌细胞的增殖。circRNA还可以通过影响信号通路发挥作用。雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，MTOR）是磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋 白 激 酶 B（protein kinase B，PKB，又称AKT）的下游分子，AKT/MTOR通路是介导肿瘤代谢动态平衡的经典信号通路之一[23]。circNRIP1作为miRNA-149-5p的海绵，通过AKT/MTOR介导的代谢和上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）途径促进胃癌的进展[24]。以circNRIP1为靶点探索胃癌的新的治疗方法具有很好的应用前景。

2.2.3 circRNA与结直肠癌结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，在中国，其发病人数为38.8万，仅次于胃癌[5]。目前，手术和化疗是肠癌的主要治疗方式，但患者预后仍较差。有研究采用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）发现，circCCDC66在结肠癌中的表达水平较高，过表达的circCCDC66可增强结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力[25]。Zhang等[26]从198个在结肠癌中表达上调的circRNA中筛选出表达差异明显的hsa_circ_0055625，并通过进一步的实验分析发现，hsa_circ_0055625的表达与肿瘤TNM分期和转移有关，并下调miRNA-106的表达可减少对整合素β8（integrin β8，ITGB8）的抑制，进而促进肿瘤的生长和转移。circDDX17可作为肿瘤抑制因子在肠癌中发挥作用，且其表达水平与临床病理参数有关，后期可能成为肠癌诊断的潜在生物标志物和治疗靶点[27]。

2.2.4 circRNA与胰腺癌胰腺癌的恶性程度高，由于缺乏早期诊断和有效的治疗，预后最差[28-29]。circLDLRAD3在胰腺癌细胞和组织中呈高表达。miRNA-137在胰腺癌中呈低表达，并与肿瘤大小、淋巴结转移情况、肿瘤分期和预后不良密切相关。circLDLRAD3可直接靶向miRNA-137，上调circLDLRAD3的表达，从而减轻miRNA-137对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭方面的抑制作用[30]。Chen等[31]发现，miRNA-124与circRNA_100782具有结合位点，miRNA-124降低了白细胞介素6受体（interleukin-6 receptor，IL6R）和信号转导及转录激活因子 3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）的mRNA水平以及IL6R、磷酸化的JAK2（phosphorylation-JAK2，p-JAK2）、STAT3和 磷 酸 化 的STAT3（phosphorylation-STAT3，p-STAT3）蛋白的水平。这些结果表明，circRNA_100782可通过IL6-STAT3途径与miRNA-124相互作用进而调控肿瘤细胞的增殖。circRNA的检测为胰腺癌的早期诊断及治疗提供了新的途径。

2.2.5 circRNA与肝癌慢性乙型或丙型肝炎病毒感染、酗酒、免疫相关肝炎、肥胖等诸多因素均可导致肝癌发生。circ-DB被发现在体脂率高的肝癌患者中的表达水平升高，Zhang等[32]结合已有的研究报道和生物信息学预测分析发现，circ-DB可与miRNA-34a结合，调控其下游靶基因USP7的表达，诱导下游肿瘤基因相关的靶蛋白去泛素化增强，调控肿瘤相关蛋白cyclin A2的表达，减轻肝细胞癌的DNA损伤，促进肝细胞癌的增殖和迁移。另外，cSMARCA5被证实其表达水平的下调与肝细胞癌的侵袭性特征有关，其不仅可以抑制肝癌细胞的增殖和迁移，还可以促进肿瘤抑制因子组织金属蛋白酶抑制剂3（tissue inhibitor of metalloproteinase 3，TIMP3）的表达[33]。circMTO1 亦被发现作为miRNA-9的海绵促进p21的表达，从而抑制肝癌的进展，提示circMTO1可成为治疗肝癌的潜在靶点。通过与临床病理参数的相关性进行分析，推测circMTO1也可能成为肝细胞癌患者预后不良的重要预测指标[34]。因此，寻找新的生物标志物对肝癌的治疗及改善肝癌患者的预后至关重要。

2.3 circRNA与乳腺癌

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，中国每年新发病例约为30.4万[5,35]。乳腺癌的分子亚型可分为Luminal型、Basal-like型、人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）（+）型和Normal breast-like型。三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）的侵袭性最强，且致死率和复发率均高。Ye等[36]发现，过表达的circFBXW7能够明显抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移；深入研究发现，circFBXW7不仅可充当miRNA-197-3p的海绵，还可编码FBXW7-185aa蛋白，上调FBXW7的表达，下调c-myc的表达，从而发挥抑制TNBC细胞增殖和迁移的作用。EMT广泛参与胚胎器官发育、伤口愈合和肿瘤转移等生理和病理过程。研究证明，circANKS1B在乳腺癌中的表达水平升高，可激活转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）/Smad 信号通路，诱导EMT，进而促进乳腺癌在体内、体外的侵袭和转移，但对乳腺癌的生长无影响[37]。circ-叉头框蛋白O3（forkhead box O3，FOXO3）通过促进p53的泛素化修饰和降解，稳定FOXO3蛋白的表达，最终导致靶基因p53正向凋亡调节因子（p53 up-regulated modulator of apoptosis，PUMA）的表达上调，同时增加细胞凋亡的敏感性[38]。因此，circRNA可能是未来治疗乳腺癌的一个新靶点。

2.4 circRNA与宫颈癌

近年来，宫颈癌的发病年龄逐渐趋于年轻化，因此，寻找新的生物标志物进行早诊断、早治疗至关重要。Cai等[39]发现，hsa_circ_0000263通过作用于miRNA-150-5p进而上调鼠双微体4（murine double minute 4，MDM4）的表达来抑制p53的表达，从而促进宫颈癌的发生。另外，hsa_circRNA_101996被证明可以作为miRNA-8075的海绵，靶向宫颈癌细胞中的爪蟾驱动蛋白样蛋白2靶蛋白（targeting protein for Xenopus kinesin-like protein 2，TPX2），抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭[40]。手术是宫颈癌的一个重要治疗手段，但是，晚期宫颈癌患者由于发生了转移而失去了手术切除病灶的机会，又不能承受放化疗带来的不良反应，因此，寻求新的治疗靶点显得尤为重要。

2.5 circRNA与甲状腺癌

甲状腺癌是内分泌系统常见的恶性肿瘤，一般分为4种类型，最常见的是乳头状甲状腺癌，其次是滤泡癌、髓样癌和未分化癌。WNT/β-catenin信号通路是一条经典途径，其异常激活通常导致多种恶性肿瘤的发生。circRNA_102171与CTNNBIP1相互作用，阻断其与β-catenin/Tcf3/Tcf4/LEF1复合物的相互作用，从而激活WNT/β-catenin通路促进乳头状甲状腺癌进展[41]。Notch信号通路可通过调节肿瘤微环境、肿瘤血管生成以及肿瘤的发生、进展、侵袭和转移，参与多种肿瘤的发生与发展。Yao等[42]发现hsa_circ_0058124高表达与肿瘤分期、肿瘤大小、甲状腺外侵犯、淋巴结转移情况、远处转移情况均呈正相关，作为miRNA-2185p的ceRNA上调Numb的表达从而抑制Notch3通路，从而促进乳头状甲状腺癌的发展。可见，circRNA有助于甲状腺癌的早期诊断及治疗。

2.6 circRNA与脑瘤

根据2018年全球癌症统计数据，中枢神经系统肿瘤的新发病例占所有肿瘤新发病例的1.6%，占所有恶性肿瘤相关死亡病例的2.5%[43]。有研究发现，circAKT3能够编码长度为174个氨基酸的蛋白质AKT3-174aa，进一步研究发现AKT3-174aa主要影响AKT2/3分子的磷酸化，负调控PI3K/AKT信号通路，从而起到抑制脑肿瘤发生、发展的作用[44]。真核生物起始因子4A3（eukaryotic translation initiation factor 4A3，EIF4A3）诱导的circ-基质金属蛋白酶 9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）可 作 为miRNA-124的海绵上调细胞周期蛋白依赖激酶4（cyclin-dependent kinase 4，CDK4）和极光激酶 A（aurora kinase A，AURKA）的表达，促进多形性胶质母细胞瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，促进胶质母细胞瘤的形成[45]。Ding等[46]证实环状核转录因子Ⅸ（circular RNA nuclear factorⅨ，circNFⅨ）是miRNA-378e的海绵，miRNA-378的表达量因circ-NFIX过表达而明显降低，并因circNFIX的敲降而增加。核糖体结合蛋白Ⅱ（ribophorinⅡ，RPN2）是miRNA-378e的靶标。沉默circNFIX可通过调节miRNA-378e/RPN2轴抑制胶质瘤的进展。一些circRNA已被发现在胶质瘤中发挥致癌作用，而另一些circRNA则被报道具有肿瘤抑制作用，circRNA也可能成为未来脑癌治疗的理想选择。

3 小结与展望

由于RNA技术的飞速发展，越来越多与肿瘤密切相关的circRNA被发现。大量研究证明circRNA在各种肿瘤组织和正常组织中的表达存在差异，并参与各种病理过程，包括凋亡、增殖和侵袭等方面。目前，对circRNA功能的认识尚不完全，关于其在恶性肿瘤中作用的机制主要集中于作为miRNA海绵的功能方面的研究。一些circRNA在相关的信号通路中与不同的蛋白相互作用，调节细胞活动。此外，circRNA与EMT有关，且circRNA通过EMT转录因子、EMT相关信号通路等机制调控EMT的进展。一些特异性表达的circRNA有望成为一种肿瘤标志物，为肿瘤的早期诊断及治疗提供新的靶点。