基于液相色谱-质谱联用的代谢组学技术研究Pokemon诱导的胞内脂代谢变化

金一宝,李上富,王 珏,高 丹,刘红霞,蒋宇扬,殷 果,王铁杰*

(1.深圳市药品检验研究院,深圳市药品质量标准研究重点实验室,广东 深圳 518057;2.清华大学深圳研究生院,广东 深圳 518055)

Pokemon蛋白是由染色体19p13.3区带ZBTB7A基因编码的产物,作为一种转录抑制因子,能够通过影响染色质的重组或直接与抑癌基因结合而抑制抑癌基因的转录,从而促使肿瘤形成[1,2]。2005年美国癌症研究中心[3]提出Pokemon的调控机制可能是通过Pokemon-ARF(alternative reading frame)-MDM2(murine double minute2)-P53细胞信号传导通路。Zu等[4]绘制了Pokemon介导的基因调控网络,发现Pokemon的调控作用主要分布在代谢、基因转录调控和细胞信号转导等生命活动中,其中有74个基因与机体代谢有关,涉及44条代谢途径。但Pokemon在肿瘤基因调控代谢网络中所起作用还不是十分清晰,需要进一步的研究。

代谢组学是近年来新的研究技术手段,是继基因组学、转录组学、蛋白质组学后系统生物学的另一重要研究领域,主要研究生命体在受外界或自身改变的情况下小分子代谢物的变化[5,6]。代谢物处于基因组和蛋白质组的下游,通过研究代谢物的变化,反推基因和酶的调控过程。代谢组学作为一种新的组学方法在疾病机制研究方面具有广阔的应用前景[7]。目前,代谢组学已在肿瘤发病机理、肿瘤标志物鉴定、疾病诊断、动物模型、药物毒性和机理研究、基因功能的阐明等方面取得了突破和进展[8-12]。

本文利用代谢组学技术,比较了肝细胞HL7702瞬时转染Pokemon基因所获得的高表达细胞与对照组细胞的代谢途径和代谢物质的变化,获得了Pokemon介导的肝癌细胞代谢差异,探讨肝细胞中Pokemon引发的小分子代谢物、酶和调控基因之间的相互关系,研究Pokemon作为原癌基因在肝癌发生发展中的作用机制和功能。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

HF safe1500生物安全柜、HF240型二氧化碳培养箱(中国力康),IX5型倒置相差显微镜(日本Olympus),超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪(UPLC/Q-TOF MS,美国Waters),Direct-QTM超纯水设备(美国EMD Millipore),Allegra 64R高速控温离心机(美国Beckman Coulter)。

pEGFP-N3/Pokemon及pEGFP-N3质粒由清华大学深圳研究生院保存;聚合酶链式反应(PCR)引物序列由吉泰生化(中国)合成;Trizol、LipofectamineTM2000脂质体转染试剂购于life technologies(美国);乙腈(LC-MS级)、甲醇(HPLC级)、蛋白质浓度测定试剂盒、显影定影试剂盒、1640培养基、胎牛血清均购于Thermo Fisher Scientific(美国);Pokemon抗体、甲酸(LC-MS级)、亮氨酸-脑啡肽(LE,200 μg/L)均购于Sigma-Aldrich(美国);己糖激酶(hexokinase)抗体、肝磷酸果糖激酶(PFKL)抗体、丙酮酸激酶(PKM1/2)抗体、乙酰辅酶α羧化酶(Accα)抗体、脂肪酸合成酶(FASN)抗体均购于Cell Signaling Technology(美国)。逆转录试剂盒、Realtime PCR试剂盒均购于宝生物工程有限公司(中国);彩色预染蛋白质分子量标准、β-actin抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊二抗、磷酸盐缓冲液(PBS)购于碧云天生物技术研究所(中国);0.22 μm尼龙滤膜购自天津博纳艾杰尔科技有限公司(中国);超纯水由Milli-Q纯水系统制得。

1.2 Pokemon高表达的HL7702细胞转染

HL7702细胞为人类肝来源的上皮细胞(购自中科院上海细胞库),在培养皿内培养HL7702细胞,使其12～16 h后细胞融合度达到75%～80%。按LipofectamineTM2000脂质体转染试剂说明,分别用优化培养基稀释pEGFP-N3/Pokemon质粒(对照组细胞,采用pEGFP-N3质粒进行转染)和LipofectamineTM2000,混合质粒和转染试剂,静置20 min,使脂质体充分包覆质粒。弃去细胞培养基,更换无双抗的培养基,转染试剂滴入培养皿中,在37 ℃、5%CO2浓度的环境下培养4～6 h后更换培养基,通过观察荧光表达判断转入基因表达情况。

1.3 Realtime PCR

细胞培养至细胞数约为2×105个,利用Trizol提取细胞中的总RNA。使用TaKaRa逆转录试剂盒,取1 μg总RNA,加入DNA酶、无RNA酶水和RNA酶抑制剂,去除体系中可能的DNA污染。采用逆转录试剂盒生成cDNA。将所得到的cDNA采用Realtime PCR试剂盒配制20 μL的反应体系,上游引物5′-GAAGCCCTACGAGTGCAACATC-3′、下游引物5′-TGGTTCTTCAGGTCGTAGTTGTG-3′(147 bp)。PCR反应条件按照三步法进行:第一步,1次循环,95 ℃维持10 s;第二步,40次循环,95 ℃变性5 s,60 ℃退火5 s,72 ℃延长34 s;第三步,解离延长步骤。通过数据统计分析,计算细胞中Pokemon的mRNA水平表达差异。

1.4 免疫印迹(Western Blot)实验

细胞中加入已预冷的细胞裂解液,提取蛋白质,通过蛋白质定量试剂盒测定蛋白质浓度。配制SDS(十二烷基磺酸钠)-聚丙烯酰胺凝胶,将已处理好的样品及彩色预染蛋白质相对分子质量标准加于上样孔内,恒压电泳。取出电泳凝胶,采用恒流电泳将蛋白质条带转移至硝酸纤维素膜上。取出硝酸纤维素膜,室温封闭。加入用0.05 g/mL BSA(牛血清白蛋白)溶液稀释的抗体,于4 ℃孵育过夜。洗膜后,加入HRP标记的二抗,室温孵育后洗膜。使用显影定影试剂盒通过凝胶成像系统扫描,检测目标蛋白质的相对浓度,以条带的浓淡呈现。

1.5 细胞的代谢组学实验

1.5.1细胞样品前处理

细胞生长状态达到对数生长期(90%融合率),用预冷的PBS清洗两次,计数1×107个细胞,置于离心管中,离心弃去PBS,加入600 μL甲醇-水(3∶1,v/v),旋涡混合。冰浴超声破碎,在4 ℃以16 000 g的速度离心10 min[13]。取上清液,用氮气吹干,用1 mL乙腈-水(1∶1,v/v)复溶,加入LE(质量浓度为200 μg/L,溶剂为乙腈-水=1∶1,v/v)为内标,在4 ℃以16 000 g的速度离心10 min,用0.22 μm尼龙滤膜过滤,置样品瓶中,进样分析。

1.5.2液相色谱-质谱联用分析

色谱采用Acquity BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm,美国Waters)。流动相A为水(含0.1%(体积分数,下同)甲酸),流动相B为乙腈(含0.1%甲酸)。梯度洗脱程序(体积分数):初始比例为5%B,在8 min内线性增长至98%B,然后保持2 min,随后恢复为5%B,并平衡2 min。流速为0.5 mL/min,进样室温度为4 ℃,柱温为30 ℃,进样量为10 μL。

质谱使用电喷雾电离源(ESI),采用正离子检测模式,锥孔电压为40 V,采集时间为0.2 s,采集间隔为0.02 s。扫描范围为m/z100～1 000。使用锁定质量模式(lock mass)对仪器进行实时质量校正,参考物质为质量浓度为100 μg/L的LE溶液(溶剂为乙腈-水=1∶1,v/v),流速为0.05 mL/min,采集间隔为10 s。

1.5.3数据处理

采用MarkerLynxXS软件(V4.1,Waters)对原始数据进行色谱峰识别、谱图滤噪、基线校正以及峰匹配,并通过读取总离子流色谱图中峰信息,利用软件中包含的Ezinfo软件根据上述变量进行多元统计,以主成分分析(PCA)对变量进行降维并将其聚类,绘制主成分分类图。

1.5.4标记物鉴定

将所选出的差异代谢物,根据其m/z,通过数据库检索,获得其可能结构,并利用Q-TOF MS/MS采集二级质谱图进一步对其结构进行确证。

2 结果与讨论

2.1 细胞内Pokemon表达水平

观察HL7702细胞的转染效果(见图1a),可看出在12 h时已有细胞表达出绿色荧光,48 h后达到荧光比例最多,72 h持续该状态,96和120 h荧光减弱。分别收集转染后12、24、48、72、96及120 h的细胞进行Realtime PCR和Western Blot验证细胞中Pokemon的表达效率。从图1b中,可看出HL7702细胞在转染24 h时,Pokemon的mRNA表达水平升至最高,而蛋白质表达水平的升高要在48 h才能达到最高(见图1c)。在72 h后,随时间的延续,表达水平出现降低。该结果与绿色荧光照片的结果一致。

2.2 细胞代谢组学分析

2.2.1代谢指纹图谱

采用超高效液相色谱与高分辨质谱联用技术对已构建的Pokemon高表达的HL7702细胞株与其对照组细胞进行分析,分别按转染后12、24、48、72和120 h观察Pokemon影响下的细胞内代谢物的变化。通过色谱分离和质谱检测,得到细胞的总离子流色谱图,对比图2中细胞代谢物的指纹图谱(转染后48 h),发现与对照组细胞相比,色谱图之间峰形具有差异。比如,在4.13、6.77、7.60以及8.30 min前后的色谱峰有明显不同,表明两组细胞的代谢物含量发生了变化。

图1 HL7702细胞转染Pokemon基因后Pokemon的表达(n=3)Fig.1 Expression of Pokemon in HL7702 cells transfected with the Pokemon gene (n=3)a.fluorescent expression;b.mRNA expression (n=3);c.protein expression.Pokemon+:Pokemon overexpressing cells.

图2 HL7702细胞转染Pokemon基因48 h后总离子流色谱图Fig.2 Total ion chromatograms of HL7702 cells transfected with the Pokemon gene at 48 ha.Pokemon overexpressing cells;b.control cells.

图3 HL7702细胞转染Pokemon基因后12、24、48、72及96 h细胞的主成分分类图(n≥5)Fig.3 PCA (principal components analysis)of HL7702 cells transfected with the Pokemon gene at 12,24,48,72,and 96 h (n≥5)HP:Pokemon overexpressing cells;HN:control cells.

2.2.2主成分分析

根据获得的色谱质谱数据,采用MarkerLynxXS软件分析得到细胞主成分分类图。从图3细胞的分类及分布趋势图中可看出,HL7702转染Pokemon基因后能够与对照组细胞分类,并且随着转染时间的延长(0～48 h)分类越来越明显。另外在图3中还可以看出Pokemon高表达的HL7702细胞与对照组细胞呈现随时间远离后又恢复的趋势,说明Pokemon表达水平的改变对细胞的自身代谢产生了显著的影响。

表1 Pokemon基因转染48 h后的HL7702细胞与对照细胞相比胞内代谢差异物鉴定Table 1 Identification of different intracellular metabolites between HL7702 cells transfected with the Pokemon gene and control cells at 48 h

Note:the levels of metabolites were increased (↑)or decreased (↓)in cells transfected with the Pokemon gene for 48 h relative to the levels in control cells.DG:diacylglycero;PAF:platelet activating factor;PC:phosphocholine;PS:phosphatidylserine;SM:sphingomyelin.

2.2.3差异代谢物鉴定

Pokemon表达水平的改变影响细胞的自身代谢,根据细胞主成分分类图(见图3)选择转染后48 h的两组细胞进行F检验和t检验分析,筛选对分类具有较大贡献的代谢物(p<0.05)。通过数据库(HMDB[14]和METLIN[15])检索和二级图谱比对进行结构解析,发现在Pokemon影响下,多种胞内代谢物与对照组细胞相比含量发生了变化,本试验确证了5种氨基酸类、4种核苷类代谢物以及27种脂类代谢物,结果见表1。

图4 HL7702细胞转染Pokemon基因后4种代表性脂类在不同时间点的变化倍数(n=5)Fig.4 Fold change of four representative lipids at different time points in HL7702 cells transfected with the Pokemon gene (n=5)

表1和图4表明,在HL7702转染Pokemon基因后,细胞内的脂肪酸类代谢物含量明显增加,磷脂类代谢物同样增加,而溶血磷脂类代谢物减少。通过查询KEGG数据库发现软脂酸(palmitic acid)作为脂质合成的第一产物[16]和差异代谢物,在细胞转染后出现伴随Pokemon的表达水平升高而升高,同时随时间延续,Pokemon表达水平逐渐恢复,代谢差异物的含量变化水平有所回调,推测Pokemon高表达后可激活细胞内的脂质合成。

2.3 脂质合成关键酶的表达水平

通过检测Pokemon高表达对细胞中脂质合成信号通路关键酶的影响来证实Pokemon对细胞脂质合成通路的激活作用,ACCα和FASN是催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A合成长链脂肪酸软脂酸(palmitic acid)的关键酶。文献[17]显示,FASN在很多肿瘤中过表达和过活化。已有文献证实Pokemon直接激活FASN[18],为癌细胞的快速增殖提供更多的磷脂膜成分。从图5中可看出,伴随Pokemon蛋白质表达水平的增加,细胞内的FASN表达水平明显升高,其中FASN表达量增加的时间点与Pokemon转染后过表达的时间点吻合,同时ACCα的表达水平在细胞转染48 h后,也出现增加,说明ACCα可能是被Pokemon间接激活的。对关键酶表达水平的验证表明,Pokemon可激活细胞内脂质合成途径,促使细胞内形成包含脂肪酸、磷脂、甘油二酯等大量的脂类物质。所产生的大量磷脂类成分可用于构建细胞膜,结合细胞内增加的ATP等能量物质用于细胞增殖[19],而这种细胞的大量无限性增殖是肿瘤形成过程中的关键步骤。

图5 HL7702转染Pokemon基因后不同时间点脂质合成关键酶ACCα和FASN的表达水平Fig.5 Expression of ACCα (acetyl-CoA carboxylase α)and FASN (fatty acid synthase),key enzymes for lipid synthesis,at different time points in HL7702 cells transfected with the Pokemon gene a.Pokemon overexpressing cells;b.control cells.

3 结论

利用LC-MS技术,对不同时间点转染Pokemon基因的HL7702细胞进行代谢组学研究。提取细胞的内源性代谢物,利用LC-MS进行分离和鉴定,获得差异表达谱,通过多元统计的方法进行数据处理,得到不同时间点的分类结果。当细胞内的Pokemon表达水平发生变化时,细胞内的多种代谢物的量值也发生明显改变,尤其是脂类代谢物。Pokemon高表达时细胞内的脂肪酸类、磷脂类代谢物的量增加,溶血磷脂类代谢物的量减少,研究结果表明Pokemon高表达后可激活细胞内的脂质合成。蛋白质表达水平的验证进一步证实了Pokemon能够激活细胞内脂质合成途径。本研究表明细胞内Pokemon的高表达,可以激活脂质合成通路,促使细胞内脂类合成加快,为癌细胞提供增殖所需的细胞膜原料。

致谢 感谢南伊利诺伊医学院曹德良教授在生物学工作中的帮助与指导。