液体活检指导非小细胞肺癌治疗的研究进展

周芳 ，潘小平

（1.内蒙古医科大学附属人民医院，内蒙古 呼和浩特；2.内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特；3.内蒙古国际蒙医医院，内蒙古 呼和浩特）

1 循环肿瘤细胞（CTC）的研究进展

循环肿瘤细胞[3]是来源于原发肿瘤或转移肿瘤，获得脱离基底膜的能力，并进入外周血液循环中的肿瘤细胞。它可以造成恶性肿瘤的术后复发以及远处转移,更严重即造成患者的死亡。外周血中CTC 的检测对肺癌的早期诊断、疾病的监测和预后评价具有非常重要的意义，具有作为指导肺癌个体化治疗的预后生物标志物的巨大潜力。CTC 在血液中的含量非常少，每毫升血液中大约含有100 万血细胞，但其中约含有的CTC 有1 个。因此若要有效地检测其数量，则需要在外周血中对其进行富集。虽然在很久之前就开始了对CTCs 的研究, 但在各种恶性肿瘤中，它的潜在用途还没有完全用于临床的诊疗中。主要原因是循环血中CTCs 的含量非常少, 而就目前的检测技术来说，CTCs的检测还是非常困难，这也一直是CTCs 研究中的难以解决的问题[4]。

提取血液中的CTC 可以通过基于细胞直径大小和其它生物物理特性的负性富集来进行分离，也可以通过使用CTC 表面的细胞标志物如上皮细胞黏附分子(EpCAM)进行正性富集来进行分离。但是目前仍旧缺乏能够区分CTC 与非恶性上皮细胞的标记, 况且,由于肿瘤细胞直径大小相差较大,基于细胞直径的提取方法会导致大量CTC 的丢失。目前,在转移性CRC患者中，分离和计数CTC 的平台是CellSearch，它是唯一一个经FDA 批准的,国际上最为稳定和可靠的CTC检测系统[5-10]。

CTC 与肿瘤的复发和转移有关。CTC 分析为肺癌的预后评估和治疗干预提供了实时“液体活组织检查”的前景。外周血标本容易获得且对人体的伤害较小，遂可重复采集。它们是常规临床试验的理想来源，被认为是“液体活检标本”，而不是原发的肿瘤。但是，在临床使用中，CTC 检测仍存在着很多困难，如没有特异性肿瘤标志物、没有统一规范的检测指标、无法取代传统的影像学检查、而且检测费用相对高等。随着CTC检测方法的不断更新，很多根据CTC 敏感性，以及特异性的无创CTC 检测措施会得到进一步发展，为肺癌的诊断以及治疗带来新的检测手段以及新的理论根据[11]。

2 循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA,ctDNA)的研究进展

肿瘤患者血液中的CfDNA 包括非肿瘤来源的DNA 和肿瘤来源的DNA, 后者又被称为CtDNA, 它可以来源于凋亡的肿瘤细胞、活肿瘤细胞和CTCs。其基因图谱与相应肿瘤的基因图谱非常匹配,能够真实可靠的反映患者的肿瘤信息[12]。在CfDNA 中，非肿瘤来源DNA 浓度较高,而CtDNA 的浓度很低[13]。根据过去的研究，我们发现,如要完整地获取肿瘤的信息，则需要满足CtDNA 在CfDNA 的含量超过10%以上。目前认为[14],cfDNA 大部分是长度为150～200 个碱基对的双链片段，它们进入血液的途径是细胞凋亡和坏死。研究发现,在健康人血浆中,正常细胞cfDNA 浓度约为30μg/L,而肿瘤患者则为180μg/L,且血浆中cfDNA会被很快地清除, 所以其半衰期很短。早在1977年,Leon 等就得出结论：癌症患者cfDNA 总体水平较高，未患癌人群较低。

由于来自肿瘤的cfDNA 含量低、半衰期短,且不同癌症患者之间个体差异大,因此需要超灵敏的方法来检测血浆中的cfDNA。如今已有多种方法可以检测血浆cfDNA 中的基因突变情况, 包括测序法、荧光定量聚合酶链式反应（PCR）、扩增阻滞突变系统（ARMS)、突变富集PCR、变性高效液相色谱法以及数字PCR。然而,受到DNA 聚合酶错误率和测序反应的影响，这些方法的灵敏度和特异度较低。针对cfDNA，新一代测序(NGS)方法进行了很多改变,多项研究表明,NGS结合了深度测序覆盖、分子条形码方法和错误抑制算法的改良方法改进了检测限,检测的准确性和敏感性也随之得到了很大的提高[15]。

3 循环肿瘤RNA 及外泌体的研究进展

分泌外泌体Exosomes[16-17]的各种来源有, 淋巴细胞、树突状细胞、肥大细胞及上皮样细胞、肿瘤细胞等。囊泡类小体的直径约为40～100 nm, 是由这些细胞分泌的，具有典型的脂质双分子层膜结构，其携带有母细胞多种蛋白质、脂类、DNA 和RNA 等重要信息，在细胞和细胞间的物质交换和信息传递起到重要作用[18]。外泌体是一种30～150nm 的双层膜囊泡，血液当中的很多细胞都可以释放外泌体，例如：血细胞、内皮细胞、免疫细胞、血小板和平滑肌细胞等。外泌体中含有很多生物遗传信息：蛋白质以及DNA、mRNA 和miRNA 等核酸，在细胞间进行信息交换和调节受体细胞活动。

外泌体含有大量的遗传信息mRNA 和miRNA,miRNA 是具有功能活性的成分，也是外泌体中研究最多的成分。miRNA 是血液中含量最丰富的cfRNA 分子，许多物质可以携带miRNA，外泌体、凋亡小体、蛋白质-miRNA 复合物和肿瘤血小板就具有这一功能。最近的研究表明, 这些外泌体能够用来检测疾病的进展，是一种很有优势的标志物，甚至在病人出现临床症状前做出肿瘤诊断、预后判断、疗效评估。肿瘤来源的Exosomes 促进肿瘤的生长, 转移和耐药。目前对于外泌体的分离提纯方法包括高速离心法, 密度梯度离心法, 色谱法, 超滤膜过滤离心法等。在NSCLC 患者中，Exosomes 分泌的与肿瘤有关联的蛋白有EGFR、KARS、claudins、RAB 家族蛋白等[19-20]。

NSCLC 外泌体的研究有重要的临床意义, 但要投入临床使用中还需大量研究。很多问题均可干扰外泌体的miRNA 的表达, 导致其特异性和灵敏性较差, 目前提纯外泌体的方法还没有完全找到, 外泌体的分离和纯化过程还需要认真探索。在miRNA 的研究中，肿瘤组织和外泌体相差很大[21]，在临床上还不能进行更多的使用。

4 小结

液体活检是一种很有前途的微创检测方法，可以检测血液中的循环肿瘤DNA（ctDNA）或循环肿瘤细胞（CTCs）。尽管ctDNA 的存在是30 多年前首次被描述出来的，但对它的密集研发直到20 世纪10 年代才开始。

目前大量的研究正在寻找一种理想的方法:其足够敏感、特异、可靠、可重复，可以用于早期诊断或预测肺癌的发展。尽管人们普遍热衷于利用这一检测方法达到目的，但目前还没有证据支持临床有效性以及液体活检在肺癌早期诊断中的应用。综上所诉，液体活检作为无创的检测手段，外周循环血中的CTCs、ctDNA、ctRNA 及外泌体可实时动态检测肿瘤患者的病程，为非小细胞肺癌患者的分期、疗效评价、预测预后、耐药检测及个体化治疗提供了新的途径。在效用和适用性方面，液体活检不断完善研究，改善问题，以最快的速度投入到临床的应用中。但其在诊疗过程中也表现出很多的问题：一是分析前阶段存在的难度，如血液中的生物标志物来说，血液采样和分析阶段之间的时间必须尽量缩短;所有患者最好可以在相同条件下进行检测，才能达到更好的研究效果。二是在肿瘤体积非常小或者在胸部影像学上不可见的患者中，其血液中的生物标志物含量较低，这加大了检测技术的难度和灵敏度。三是检测癌症特异性生物标志物，尤其是肺癌，虽然目前已经取得了不错的成效，但是针对分析前的处理和具体的分析步骤尚且没有达到标准化，这也是当前在临床实践中将液体活检用于癌症早期诊断的一大难题。

由于需要很高的技术水平和费用，而且没有统一规范的诊断标准，液体活检真正用于非小细胞肺癌的临床诊疗中，还有很长的路要走。需要进一步的探索来描述非小细胞肺癌中液体活检各项指标的标准化、临床验证和基于成本的分析。随着检测技术的提升，检测速度的加快，液体活检技术可以加速向临床发展，更加快速地实现精准医疗的梦想。