结直肠癌纳入标准对肠道菌群分析的影响△

吴思宇，马玉芳

武汉科技大学附属天佑医院肿瘤科，武汉4300640

结直肠癌是一种多因素疾病，从20 世纪末开始，人们就关注到肠道菌群是结直肠癌甚至腺瘤性息肉（adenomatous polyp，AP）的潜在危险因素，但限于取样、实验技术等各种因素，有关结直肠癌致病菌群的研究一度停滞。随着高通量测序和分子生物分类等方法迅速填补传统微生物学技术存在的空白，以及人类肠道微生物群及其相关代谢谱综合目录的建立，21 世纪初各种相关试验呈如火如荼之势。更令人惊喜的是，肠道主要菌群的检出和潜在生物标志物的发现为早期检测结直肠癌及寻找治疗靶点提供了参考依据。但由于全世界检测结直肠癌肠道菌群的单个试验样本量往往较小，且无法因研究人群的年龄、地区、基础疾病等差异做出相应调整，严重影响了研究者分析肠道菌群的丰度及与结直肠癌的关系[1-5]，甚至还出现了研究结果不一致的现象[6-7]。本研究从以下方面综合分析结直肠癌肠道菌群的影响因素：性别、年龄、地区、饮食习惯、既往病史、抗生素和益生菌使用情况、检测部位、检测样本等，旨在综合考量混杂因素，厘清纳入人选条件，现报道如下。

1 性别与年龄因素

研究表明，男性结直肠癌的发病率较高，女性则易患近端结肠肿瘤，且性别不同的结直肠癌患者的发病率也会随年龄增长而发生变化[8]。有研究证实肠道菌群可以影响人体内雌激素水平，进而在一定程度上抑制某些恶性肿瘤的发生[9]。目前有关结直肠癌肠道菌群的研究在纳入人选时大多数已考虑性别对结果的影响，且大型荟萃分析可以使男女比例大体相当。

年龄与结直肠癌的发病率及部位有关。研究表明，年长者患结直肠癌的风险更大[8]。随着高龄患者对此病的重视及结直肠镜检查的普及，整个结直肠癌群体正在年轻化[10]。大多数研究的试验组患者（结直肠癌患者）较健康人群的平均年龄偏大，考虑与结直肠癌发病率随年龄增高有关。有研究显示，具核梭形杆菌（Fusobacterium nuclea‐tum）在年龄较大的结直肠癌患者中具有重要作用，尤其是右侧肿瘤患者[11]。此外，有研究正在调查年龄对肠道菌群的影响，以期发现年轻患者中特定的致癌细菌[12]。

2 地区及饮食因素

地区及饮食是目前临床试验中涉及较少的因素。饮食方式对肠道菌群的组成、多样性和代谢能力均具有重要影响，因此饮食结构对结直肠癌肠道菌群研究的纳入人选具有较大干扰。大多数纳入研究人群为西方人，其生活方式及饮食习惯与中国人群有很大差别。巨单胞菌属（Megamo‐nas）从未被欧美国家报道，但中国结直肠癌肠道菌群实验却对其进行了关注[13]。提示针对西方人群的潜在肠道生物标志物可能对中国人群并不适用，需要拥有中国人群肠道菌群的临床研究。

一项临床试验将在美国生活的不同种族人群的肠道菌群和饮食进行了对比，发现摄入脂肪、蛋白质、肉更多的非洲裔美国人较非西班牙裔白人肠道菌群中存在更多的硫化细菌[14]。有研究将中国瑶族人群中的粪便微生物组与生活在同一农村地区的主要少数民族（壮族）和主要汉族人群的粪便微生物组进行了比较，发现食用豆类较多的瑶族人群的粪便样本中巨单胞菌属的相对丰度最低，拟杆菌属（Bacteroides）的丰度较高，但随着饮酒量的增加，普氏菌属（Prevotella）的丰度减少[13]。这一研究意味着即使在中国同一地区，饮食习惯不同也会导致肠道菌群存在明显差异。先前的研究很少涉及非洲和东南亚群体，相关研究进展会使结直肠癌肠道菌群信息更完善，数据更可靠[5]。

过滤掉地区因素后的菌群（如具核梭形杆菌）就是结直肠癌致病菌群Meta分析寻求的答案[5,11,15-17]，这些菌群将给全世界的结直肠癌患者带来福音，使人们更深入地了解结直肠癌的微生物学发病起因。对结直肠癌肠道菌群研究中纳入人选的饮食习惯进行较为详尽的问卷调查，从而分析其对肠道菌群的影响也是了解地区因素导致的肠道菌群差异化的方式之一。

3 相关疾病与结直肠癌

肠道菌群与疾病之间有着千丝万缕的联系，例如肠道细菌中大肠杆菌（Escherichia coli）的过度生长可能会导致肝癌的发生[18]，恶性黑色素瘤、肺癌人群的免疫治疗疗效与肠道菌群有关[19]。有研究提出肥胖与肠道菌群之间可能没有关联[20]，而有的研究却发现肥胖者与体型正常者的肠道菌群存在显著差异[21]。炎症性肠病、2 型糖尿病、过敏等均与肠道微生物群组成的改变有关[22]。慢性肠道炎症疾病，例如克罗恩病和溃疡性结肠炎，是由针对自身共生菌群的过度免疫反应引起的[23]。现有研究在试验后期数据处理上开发了区分糖尿病、炎症性肠病和结直肠癌的特异性微生物特征的处理方法[3]，但针对其他疾病的特异性微生物特征的处理方法还有待进一步研究。因此在后期数据处理较困难的情况下，尽可能考虑并记录体重指数（body mass index，BMI）及纳入人选是否患有其他疾病，尤其是对肠道菌群存在影响的疾病十分必要。

4 是否使用过抗生素、益生菌、抗肿瘤治疗

抗生素已被证实对肠道菌群具有影响[24]。有研究发现，抗生素组（5 例头孢类及2 例喹诺酮类）纳入研究人群肠道菌群中难辨梭菌（Clostridium difficile）、迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）、扭链瘤胃球菌（Ruminococcus torques）的丰度较未用抗生素组显著下降[25]。因此，目前大部分病例对照研究均已考虑抗生素产生的影响，并将其纳入了排除标准。

益生菌对肠道菌群的影响也相继被发现[9,26-27]。有研究指出，补充益生菌组纳入研究人群粪便中的梭菌（Clostridium）、Dorea 菌（Dorea formicigenerans）、乳酸杆菌（Lactobacillus）的丰度呈数倍升高[25]。但在了解益生菌对肠道菌群的显著影响前，很少有临床对照试验[25,28]会排除入组前1 个月内饮用肠道益生菌、酸奶等乳酸菌制品的肿瘤患者，但也有研究会在结肠镜检查的前一天，向受试者提供相同的无乳酸菌制品饮食[29]。因此在未来的研究中需要考虑益生菌对研究结果的影响。

研究发现，其他恶性肿瘤（非小细胞肺癌和肾细胞癌）患者在接受程序性死亡受体1（pro‐grammed cell death 1，PDCD1，也称PD-1）抑制剂治疗后，某些肠道菌群存在显著变化[19]。有研究将纳入研究人群接受化疗或免疫治疗前后的肠道菌群进行对比，结果发现，结直肠癌组患者治疗后未见菌群变化，然而食管癌、胃癌组患者却有细菌丰度变化[25]。上述研究结果可能与纳入研究人群的样本量较少有关，抗肿瘤治疗对肠道菌群的影响究竟有多大，需要进一步扩大样本量分析。

5 检测部位

研究表明，与远端结肠和直肠相比，近端结肠中更容易检测出具核梭形杆菌[11,15,30]。与左侧结直肠癌患者相比，右侧结直肠癌患者中大肠杆菌phylogroup B2 在统计学上的发生率更高[31]。年龄较大的人群（65 岁及以上）中近端结肠肿瘤最常见，年龄较小的人群（＜50 岁）易患直肠肿瘤，其次是远端结肠癌[8]。肿瘤在左侧或右侧对患者的整体生存期有影响，且两侧基因突变的发生率也存在差异[32]。这些肠道菌群的差异又会涉及结直肠镜肠准备不同所带来的差异。因此所得结果能否客观表示肠道菌群的变化还需进一步研究。

同时还要考虑同一结直肠癌患者的健康黏膜组织和肿瘤组织之间的肠道菌群差异是否可以代表与恶性肿瘤相关的菌群组成这一问题。不止一个研究将结直肠癌癌变的黏膜组织与周围健康组织中的肠道菌群进行了对比分析[33-34]。Burns 等[33]研究发现，肿瘤微环境中微生物的多样性增加，具核梭形杆菌和普罗威登斯菌（Providencia）富集。这支持了肠道菌群在结直肠癌的进展中具有不可或缺的作用，但同时也提示纳入研究人群的取材部位十分重要。那么结直肠癌患者肠道菌群的改变是否仅局限于肿瘤组织？针对这点疑惑，解决方式是多点取样、重复取样。

6 结直肠癌分期

大多数散发性结直肠癌是由息肉、腺瘤一步步进展而来，过程可长达几十年[35]。纳入结直肠癌患者的临床分期对研究结果具有重要影响。Yachida等[36]研究表明，结直肠癌患者肠道菌群有两种物种升高模式，具核梭形杆菌的水平从早期结直肠黏膜内癌至疾病进展到晚期一直上升。而极小链球菌（Atopobium parvulum）和龋齿放线菌（Actinomy‐ces odontolyticus）仅在疾病早期升高显著。关于同一种细菌，还存在着不同的结论。有研究指出具核梭形杆菌是恶性肿瘤发展早期从腺瘤进展为癌的危险因素，甚至在肝转移患者中也扮演着一定角色[37-38]。另有研究提示具核梭形杆菌的丰度在息肉组与正常对照组间并无差异，但粪便中具核梭形杆菌的定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）结合其他生物标志物或许可以作为早期检测结直肠癌的非侵入性方式[15]。除了具核梭形杆菌，大肠杆菌强毒株在结直肠癌的进展过程中同样具有显著变化[31]。值得庆幸的是，在意识到疾病发展是个动态演变的过程后，大量病例对照研究和队列研究开始关注结直肠癌发展各个阶段对肠道菌群的影响。早期及晚期结直肠癌患者微生物组的变化特征能够帮助人们更深入地了解结直肠癌的病因，并为早期诊断提供依据。

7 检测样本及方法

早前因为各种因素，大多数研究直接将粪便作为检测样本。后来有研究指出粪便可能包含与疾病部位无关的微生物，而活检仅代表采样点的微生物，因此粪便会在检测疾病的潜在生物标志物中引入“噪音”[29]。在寻求结直肠癌微生态紊乱的代表菌群上，肠道黏膜样品似乎比粪便样品更适合，粪便样品不能在丰富度和多样性上代表与肿瘤黏膜组织相同的微生物群。肠道黏膜管腔界面样品更适合检测某些产丁酸盐的细菌，例如真杆菌（Eubacterium）和栖粪杆菌（Faecalibacterium），因为其更适合定植在肠道黏膜表面[28]。但近年来越来越多的试验表明粪便可以反映结直肠癌的微生物特征[15-17,37,39]。

肠道菌群分析的准确性很大程度上取决于所采用的方法，而肠道菌群分析的关键步骤之一是选择基于16S rRNA的扩增子测序，并评估其对肠道菌群分析的影响，但操作存在明显的技术差异[40-42]。目前有可将细菌分类鉴定到物种水平的宏基因组全测序（shotgun metagenomics），但除了难度大、成本高、受限于计算机技术的发展外，还有分类规则几乎未获独立研究验证等问题[5,43]。除此之外，研究设计、样本收集、运输和储存、测序平台的选择、生物信息学分析流程不同、缺乏标准比较方案等均会造成一定程度上的偏倚。因此有文献将21 种具有代表性的粪便样品DNA 提取方案按照获得DNA 的数量和质量进行了测试并排名[4]。如果普及同一种DNA 提取方案，将大幅度改善全球各地肠道菌群研究结果的可比性。

8 问题与展望

结直肠癌是时间变化、个体差异、微生物群演变等多因素导致的，即结直肠癌可能不只是遗传疾病，还是微生物疾病。以上这些研究提供的信息对于以安全的非侵入性方式调节大量肠道细菌、预防结直肠癌以及找到靶向微生物的治疗药物至关重要。虽然许多研究纳入的样本量较小，但众多提供大数据后期处理方法的研究层出不穷，所有荟萃分析都在尽可能考虑混杂因素对研究结果的影响，例如纠正批次效应[44]、极值分析[6]。随着各种纳入研究人群的相关信息得到充实，各种推断被证明，以及结直肠癌纳入标准的制定，将极大程度简化荟萃分析，防止后期分析时重要物种丢失，为发现结直肠癌患者肠道菌群的改变做出贡献。