H295R细胞系类固醇生成试验的研究进展
2020-12-25王鹏敏郝卫东
王鹏敏,郝卫东*
(北京大学公共卫生学院,食品安全毒理学研究与评价北京市重点实验室,北京 100191)
内分泌干扰物(endocrine disrupting chemicals,EDCs)指外源性干扰内分泌系统的化学物质,对其筛选方法和作用机制的研究已成为毒理学研究的热点之一。目前,已经有许多筛选类固醇激素干扰物的方法,比如利用原代大鼠睾丸间质细胞、原代大鼠卵巢颗粒细胞、啮齿类动物子宫增重试验、Hershberger试验、Y-1小鼠肾上腺皮质细胞等。相较于其他试验方法,H295R细胞系类固醇生成试验不需要使用动物,也不需要进行复杂的分离操作,具有细胞系稳定,且与人的内分泌和细胞生理学关系更加紧密的优点,已成为筛选类固醇激素干扰物的首选方法和优先策略[1]。
1 H295R细胞系
1.1 H295细胞系的起源
H295细胞为人肾上腺皮质癌细胞系,具有类似未分化的人类胚胎肾上腺细胞的生理特性,能表达类固醇激素合成过程中涉及的酶类。最初由Gazdar等[2]从原发性侵袭性肾上腺皮质癌建立。用放射免疫分析法和质谱法对其进行了类固醇分泌研究,发现该细胞可分泌超过30种类固醇,有大约20种被鉴定出来,包括糖皮质激素、盐皮质激素、雄激素和雌激素。该细胞具有肾上腺皮质所有重要的酶系统,包括P450scc、CYP17、3β-HSD、17-βHSD、CYP19、CYP21和CYP11B/B2。这一细胞系可从美国标准生物品收藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)购买得到,编号为CRL-10296,悬浮生长缓慢。
1.2 H295细胞亚系——H295R和H295A
1.2.1 H295R和H295A的起源及类固醇生成H295细胞的生长状态以及类固醇生成受到培养条件的影响。Rainey等[3]通过改变培养基条件使H295细胞贴壁生长且细胞周期缩短。H295细胞在添加了Ultroser G的培养基中表现出生长速率增加。通过每3 d换一次培养液,弃去未贴壁细胞的方法,经过3个月的实验,Rainey将那些贴壁细胞筛选出来,命名为H295R。H295R细胞系可从ATCC购买得到,编号为CRL-2128。H295R细胞培养在DMEM/F12培养液中,包含L谷氨酰胺、15 mmol/L的HEPES、1%的ITS plus培养基添加剂(含有胰岛素6.25 μg/mL、转铁蛋白6.25 μg/mL、硒6.25 ng/mL、牛血清白蛋白1.25 mg/mL、亚油酸5.35 μg/mL)、1%的青霉素/链霉素、2%的Ultroser G。
H295A细胞系的分离方法与H295R类似,通过换液法去除未贴壁细胞从而选择出单层贴壁细胞[4]。H295R细胞与H295A细胞相比更接近于亲本H295细胞。H295A细胞主要产生17α羟孕酮和11脱氧皮质醇,这些是糖皮质激素的前体。H295R细胞不仅产生17α羟孕烯醇酮、17α羟孕酮、11脱氧皮质醇,而且产生脱氢表雄酮(DHEA)、雄烯二酮,这些是肾上腺性激素的前体。此外,也可在两细胞发现少量的孕酮。H295和H295R细胞均可产生睾酮,可在培养H295和H295R细胞的培养液中检出睾酮,H295A细胞则无法检出。因此,可选择利用H295R细胞作为研究调节雄激素生成机制的模型。H295A、H295R细胞在睾酮分泌量上的不同可能是因为H295A细胞表现出较高的3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)酶活性,H295R细胞表现出较低的3β-HSD酶活性和较高的17,20裂解酶活性。H295R细胞所表现出的现象与高级灵长类动物肾上腺功能初现时所具有的3β-HSD表达下降的特征一致[5]。肾上腺网状带、睾丸间质细胞和卵巢膜细胞均表达细胞色素P450(CYP450)家族CYP17的17α羟化酶和17,20裂解酶活性,因此产生DHEA[6]。3β-HSD和CYP17具有共同的作用底物。这表明3β-HSD和CYP17酶活性的平衡在类固醇生成方面起重要作用。因此CYP17是否仅具有17α羟化酶活性或同时具有17α羟化酶和17,20裂解酶活性是调控雄激素生成的关键。
出生后,人肾上腺雄激素产生关闭,直到青春期肾上腺功能初现时,肾上腺雄激素开始分泌,并且分泌量不断增加,30岁左右达到稳定阶段,随后不断下降[7]。利用免疫组化法研究人肾上腺皮质,发现在肾上腺功能初现时期,束状带(zona fasciculate,ZF)表现出细胞色素b5(CYB5)、胆盐磺基转移酶(SULT2A1)、3β-HSD表达的特殊改变。在肾上腺功能初现后,SULT2A1、CYB5显著增加,3β-HSD显著降低[8]。有流行病学研究表明[9],过早产的女性在肾上腺功能初现时具有更高的风险发展成为多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)。
目前,对肾上腺功能初现有关方面的研究知之甚少,动物模型似乎不适合此类研究。因为肾上腺功能初现仅发生在高级灵长类动物,并且肾上腺类固醇生成存在物种差异。因此,目前大多数研究者常采用H295A和H295R细胞作为研究模型。虽然H295A、H295R细胞来自同一肿瘤细胞,但H295R细胞比H295A细胞产生更多的雄激素。因此,两种不同的细胞系可能成为研究调节雄激素产生关键机制的良好模型。
1.2.2 H295R和H295A细胞的激素合成调控与应用1866年,Arnold首次描述了肾上腺皮质的组织结构[10]。肾上腺皮质由3层构成,最外层为球状带(zona glomerulosa,ZG),接着为占大部分的束状带(ZF),内层为网状带(zona reticularis,ZR),分别分泌盐皮质激素、糖皮质激素和肾上腺性激素。各层分泌不同的激素主要是各层细胞所含的促进激素合成的酶不同,因而产生不同的酶促反应,它们均以胆固醇为合成底物,与类固醇激素合成有关的酶分布于线粒体和内质网。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和钾离子(K+)主要调节球状带的类固醇生成,促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)主要调节束状带和网状带的类固醇生成。
在体内,AngⅡ作用于肾上腺球状带通过血管紧张素Ⅱ受体1(AT1)增加醛固酮的产生。研究表明H295细胞对ACTH、AngⅡ刺激无应答。相反,H295R细胞的类固醇激素生成受到AngⅡ、K+以及ACTH的调控。H295R细胞表达较高水平的AT1受体,给予AngⅡ刺激,可增加H295R细胞的醛固酮和皮质醇分泌量,睾酮分泌量有所下降[11]。给予H295A细胞AngⅡ刺激,未发现类固醇激素生成的明显改变。因此,H295R细胞可能对阐明AngⅡ调节肾上腺细胞的作用机制具有重要意义。
另一个主要调节肾上腺醛固酮生成的生理调节剂是细胞外的钾离子水平。K+可增加H295R细胞内的钙水平,进而激活钙依赖的PKC信号通路,从而增加醛固酮的生成[3]。K+也可增加AngⅠ和AngⅡ的生成[12]。甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)及甲状旁腺激素相关肽(parathyroid hormone related peptide,PTHRP)也可调节肾上腺醛固酮生成,可调节新离体的球状带细胞的醛固酮生成。PTH和PTHRP也可增加H295R细胞的醛固酮生成。PTH和PTHRP通过依赖cAMP的方式激活H295R细胞的类固醇生成。因此,H295R细胞可为醛固酮生成作用机制的研究提供适宜的细胞模型。
肾上腺皮质醇的主要激素调节物质是ACTH。ACTH/cAMP通路在调节类固醇激素生成方面起到了非常重要的作用。ACTH激活G蛋白偶联受体黑皮质素2受体(MC2R),MC2R几乎仅存在于肾上腺皮质,活化的MC2R触发cAMP的产生,进而激活蛋白激酶A和其他相关的信号通路[13]。H295A、H295R细胞均表达低水平的ACTH受体。ACTH处理可引起醛固酮生成的急速增加但此效应无法长时间维持。cAMP刺激直接增加了两细胞中类固醇的生成[14],并且cAMP的刺激作用在H295R细胞更显著,这说明cAMP信号通路在两细胞是完整的。因此在评价对类固醇生成具有较弱抑制作用的外源化学物时,可考虑给予腺苷酸环化酶激活剂forskolin刺激,使细胞内cAMP水平升高。在有forskolin刺激的条件下可能更容易观察到外源化学物的抑制作用[15]。鉴于在forskolin刺激条件下H295R细胞类固醇激素生成基因的表达与成年人肾上腺基因表达谱具有更明显的相似性[15]以及细胞生存的激素环境,可以认为在forskolin刺激条件下得到的结果更有意义。对ACTH的低反应性是这一细胞模型的缺陷。一个可供选择的策略是利用转基因技术使H295细胞系的ACTH受体表达恢复。通过对H295A、H295R细胞的比较研究可以帮助我们发现盐皮质激素或雄激素生成的重要的调节机制。
2 H295R细胞系类固醇生成试验的应用
根据OECD化学品测试指南TG456的标准操作规程,并经同行评审及多实验室验证的结果显示,H295R细胞体外传代至F5~F10代,接种浓度在2×105个/mL,培养24 h后,再染毒48 h,有利于检测激素生成的变化,通过检测培养基中睾酮和雌二醇含量来判断化学物对类固醇生成的影响。染毒时同时增加阳性组(10 μmol/L forskolin)和阴性组(3 μmol/L prochloraz),当满足阳性组睾酮生成量至少为对照组的2倍且雌二醇生成量至少为对照组的7.5倍;阴性组睾酮和雌二醇生成量为对照组的0.5倍时,符合测试准则。H295R细胞的生长状态以及类固醇的生成受培养条件的影响,特别是培养基中的血清因素会对类固醇激素的生成有较大影响。2010年,Kempná等[16]首次报道了H295R细胞的饥饿培养。他们发现H295R细胞可以在无血清的培养基中存活96 h。H295R细胞可以内源性生成胰岛素样生长因子-2(IGF-Ⅱ),内源性生成的IGF-Ⅱ能够充当自分泌生长刺激物使H295R细胞在无血清的条件下生存较长时间。
血清剥夺改变了H295R的类固醇生成,使雄激素生成增加,糖皮质激素生成减少。在无血清和胰岛素的饥饿条件下,H295R产生更多的雄激素和DHEA,抑制了HSD3B2基因的表达,3β-HSD酶活性降低;CYP17基因表达未发生改变,但显著增加了CYP17丝氨酸磷酸化,因而增加了裂解酶活性,羟化酶活性未发生改变。MAPK激酶(MEK)和ERK1/2磷酸化水平降低[17]。同样,对H295A饥饿培养也发现CYP17磷酸化的增加。
在世界范围内多囊卵巢综合征(PCOS)大约影响着5%~10%的育龄妇女。主要表现为雄激素过多、月经稀发且伴随排卵过少、促性腺激素分泌紊乱等,并且通常与胰岛素抵抗和代谢综合征有关。高雄激素血症是PCOS患者的主要表现,雄激素来源于卵巢和肾上腺。从患者体内分离出卵巢卵泡膜细胞研究其类固醇代谢,发现与正常的细胞相比3β-HSD和CYP17酶活性增加。实验表明增加的CYB5以及CYP17的磷酸化导致17,20裂解酶活性增加,这与H295R细胞特性一致[18]。因此,H295R细胞的饥饿培养可能成为研究PCOS及开发潜在治疗药物的模型。
3 H295R细胞系类固醇生成试验的研究进展与目前的解决方法
H295R试验已得到国际范围的广泛认同,美国内分泌干扰物筛选项目(endocrine disruptor screening program,EDSP)已将H295R试验用于EDSP的一级筛选(Tier 1 battery)[19]。随着高通量技术的发展,H295R试验已逐步被高通量H295R细胞系类固醇生成试验(high-throughput H295R assay,HT-H295R)所取代[20]。目前,已利用HT-H295R筛选了2 012种常见化学物,利用HPLC-MS/MS测定了11种类固醇激素,包括孕激素、糖皮质激素、雄激素和雌激素等[21],并通过计算马氏距离(Mahalanobis distance,Md)或平均马氏距离(mean Mahalanobis distance,mMd)对化学物进行优先级排序[22]。但H295R细胞系类固醇生成试验仍具有很多局限性。细胞系的类固醇生成能力以及对激动剂的反应能力可能会随着培养条件和时间的变化而发生改变,因此,体外培养所观察到的结果可能与体内的实际情况不同。对于试验结果,没有对性别差异的定性分析。比如,一种抑制雌激素生成的化学物对于女性来说可能被认为是中等或弱的内分泌干扰物,但对于男性来说可能被认为是强的内分泌干扰物。其次,H295R细胞系不涉及检测通过影响下丘脑-垂体-性腺轴(hypothalamic-pituitary-gonadal,HPG轴)而影响类固醇生成的物质。另外,存在从肿瘤细胞系到体内效应外推的局限性。未分化的细胞与性腺和肾上腺的内分泌生理是有本质不同的,特别是这一细胞系缺乏促性腺激素所必需的膜受体[23],比如黄体生成素(luteinizing hormone,LH)和卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)受体,这在性类固醇激素级联的生物合成过程中是至关重要的。H295R细胞不能准确预测化学物对性腺性类固醇生成的影响,因为H295R细胞的性类固醇生成水平比性腺低,因此限制了该方法的灵敏度。Letcher等[24]发现相较于人绒毛膜癌细胞系JEG-3(高侵袭)和JAR(低侵袭),H295R细胞对外源化学物的细胞毒作用不敏感,由此提出一个科学问题,即体外筛选化学物内分泌干扰效应的适宜模型是选择对细胞毒性更敏感的还是较不敏感的模型?因为外源化学物的内分泌干扰效应是在对细胞没有明显细胞毒性的条件下进行的,模型的敏感性会影响到对结果的分析以及化学物在生物体中阈值的制定。
有研究表明[25],1×106个H295R细胞培养48 h可产生8 ng睾酮,雌二醇产生量更低,大约是睾酮量的1/6,因此很难发现较弱的抑制剂;给予forskolin刺激后可产生29 ng睾酮[26]。1×106个Leydig细胞培养3 h即可产生30 ng睾酮[27],这一内在特性使其可以用来识别较弱的抑制剂,并且给予LH刺激后睾酮生成量可增加7.4~10.8倍。2017年,Principato等[28]首次提出将纯化的原代大鼠Leydig细胞作为H295R细胞系类固醇生成试验的补充,来评价化学物对睾丸睾酮生成的影响。他们认为那些通过H295R试验,发现对睾酮生成无抑制作用的化学物,可能会引起LH预刺激后Leydig细胞睾酮生成的改变,进而被认定为疑似内分泌干扰物。实验中他们选取了20种在H295R试验中未能引起睾酮生成降低的化学物,并把这些化学物分为两类:一类是使17α羟基孕酮水平降低(比如辛伐他汀、苄氯菊酯、叶菌唑、高氰戊菊酯等),一类使11脱氧皮质酮水平升高(比如敌菌灵、对苯二酚、强的松等),但都未引起睾酮生成的降低。他们发现,其中有85%的化学物可引起Leydig细胞睾酮生成降低。这表明Leydig细胞具有更高的灵敏度,可用于筛选H295R试验假阴性的化学物。另有研究表明,化学物对H295R细胞和Leydig细胞类固醇激素生成的影响存在相反的结果。双酚A(BPA)可引起H295R细胞雌二醇水平升高[29-33],但在Leydig细胞中可降低雌二醇水平[34],对于这些实验结果差异的原因尚不清楚。
4 展望
H295R细胞的应用范围具有巨大的开发潜能。H295R类固醇生成试验是一个简便、快捷的环境类固醇激素干扰物体外筛选方法,用来筛选非受体途径的类固醇激素干扰物和肾上腺皮质激素干扰物,使大规模的体外筛选成为可能,填补目前大量化学物有关类固醇生成干扰方面的数据空缺,因此,该方法具有广阔的应用前景。但仅根据H295R类固醇生成试验结果来认定化学物是否为内分泌干扰物是不全面的,还需进一步结合其他试验。体外实验不能像体内实验那样研究发生在体内的复杂的交互作用,缺乏与其他内分泌系统等的相互作用。因此,还需要不断完善和探索新的环境内分泌干扰物的评价方法。