乏氧诱导因子与非编码RNA的相互调控及其在肿瘤中作用的研究进展

孟 鑫，徐文清*

(中国医学科学院放射医学研究所，天津 300192)

细胞氧稳态是由一种氧敏感信号通路调控的，该信号通路的核心是一种转录因子，称为乏氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)。HIFs属于bHLH-PAS(basic helix-loop-helix Per-Arnt-Sim)转录因子超家族之一，是由氧依赖性α亚基(HIF-1α，HIF-2α与HIF-3α)与结构性表达β亚基组成的异二聚体转录因子。HIF的活性受脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylase domains，PHDs)与天冬酰胺酰羟化酶(factor inhibiting HIF，FIH)调节，乏氧状态下，PHDs酶与FIH酶活性会被抑制，促使HIF-1α蛋白保持稳定，并进入细胞核内与HIF-1β形成二聚体，促进下游靶基因的表达[1]。乏氧微环境是多数肿瘤的共同特征，癌细胞对于长时间乏氧的耐受机制可能与基因的转录或翻译水平相关，HIF作为细胞乏氧感知和适应的主要转录激活因子，在DNA和表观遗传水平上调控众多基因的表达，其作用可导致线粒体氧化代谢、葡萄糖摄取和氧化、能量生产和血管生成的改变，从而使癌细胞得以增殖、迁移和存活[2]。因此，HIF对于肿瘤发生发展过程有着重要作用。

非编码RNA(non-coding RNA，ncRNAs)是指不编码蛋白质的RNA，包括核糖体RNA(ribosomal RNA，rRNA)、转运RNA(transfer RNA，tRNA)、微小RNA(microRNA，miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)、环状RNA(circular RNA，circRNA)等多种已知功能的RNA，还包括未知功能的RNA。人类转录组分析的最新进展显示，转录输出编码蛋白质的RNA不到2%，而其余98%的RNA编码不同类别的ncRNAs，ncRNAs参与增殖、凋亡以及细胞周期进展等多种细胞功能，是疾病中重要的调控因子，研究显示ncRNAs对HIF通路相关的细胞生长、代谢和血管生成等有着重要调节作用[3]，因此探讨ncRNAs与HIF的相互调控对肿瘤的发病机制研究及治疗预后意义重大。本文就近年来HIF与ncRNAs的相互调控机制在肿瘤方面的研究进展进行综述。

1 HIF与lncRNAs

1.1 lncRNA与HIF的调控机制

lncRNAs是指基因转录长度在200个核苷酸以上且无法编码蛋白质的RNA。lncRNA在数量上远超于蛋白编码mRNA，据估计，人类lncRNA的数量接近60 000个[4]。lncRNA通过引导、支架、诱饵或海绵等机制调控基因表达，在维持细胞内环境平衡和缺氧状态下维持适应性生存具有潜在的作用[5]。

乏氧状态下，lncRNA与HIF的调控关系大致分为以下两种：①HIF与lncRNA的直接调控。有些lncRNA与HIF的直接作用是通过顺式激活HIF附近基因而实现的：HIF-2α启动子上游的转录子HIF2PUT可以直接抑制HIF-2α的表达，抑制骨肉瘤干细胞的增殖、迁移和侵袭[5]。乏氧应答元件(hypoxia response elements，HREs)存在于大多数乏氧应答的lncRNA启动子区域，lncRNA可利用HREs直接与HIF结合发挥调节作用：CF129启动子区域因包含有HREs序列，可被HIF负性调节，在胰腺癌中表达下调[1]。②HIF/lncRNA之间也可通过不同的机制发挥间接调控作用。HIF基因可以被其反义lncRNA调控，研究发现HIF的两种反义lncRNA转录子：5aHIF-1α与3aHIF-1α，对HIF-1α具有反义调控作用，HIF对aHIF-1α也有反馈调节机制，aHIF-1α与HIF-1α染色质的失活、mRNA的降解有关，并且其表达量可能与Bcl-2、Bax等肿瘤预后生物分子指标[6]以及放射抵抗[7]相关。另外，部分lncRNA还可通过miRNA发挥海绵作用对HIF进行间接调控：miR-138会直接抑制HIF-1α的表达，抑制胆囊癌细胞转移与上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)过程，LINC00152通过与miR-138绑定，间接发挥致癌作用，促进胆囊癌发展[8]。

另外，在某些肿瘤中常氧水平下lncRNA也可以调节HIF-1α的激活与积累。LINK-A在三阴性乳腺癌(triple negative receptor for breast cancer，TNBC)的HIF-1α常氧信号通路中起着重要作用。机制上，在肝素结合性表皮生长因子(heparinbinding epidermal growth factor-like growth factor，HB-EGF)的刺激下，LINK-A招募乳腺肿瘤激酶(breast tumor kinase，BRK)和富含亮氨酸重复激酶2(leucine-rich repeat kinase 2，LRRK2)到表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)-非转移性糖蛋白B(glycoprotein non-metastatic b，GPNMB)异源二聚体上，从而诱导其构象变化并激活它们的激酶活性，活化的BRK和LRRK2分别在酪氨酸565和丝氨酸797磷酸化HIF-1α。酪氨酸565位的磷酸化抑制了相邻的脯氨酸564位羟基化，进而抑制HIF-1α在常氧下蛋白酶体的降解作用；同时，丝氨酸797位磷酸化增强了HIF-1α与HIF-1α-p300相互作用，导致HIF-1α下游基因活化，促进乳腺癌糖酵解、重组和肿瘤发生[9]。

1.2 lncRNAs与HIF的相互调控在肿瘤进展中的作用

lncRNAs与实体肿瘤患者低生存率和放化疗耐药性相关，在肿瘤乏氧微环境中，lncRNAs与HIF的调控关系和肿瘤细胞增殖与凋亡、代谢、侵袭和转移等密切相关[5]。

1.2.1 细胞增殖与凋亡lncRNAs一般通过表达量上调或下调发挥着致癌或抑癌基因作用。Wang等[10]研究发现lncRNA PVT1在鼻咽癌中显著上调，并作为染色质修饰因子KAT2A的支架，介导组蛋白H3上第9位赖氨酸的乙酰化作用，募集核受体结合蛋白TIF1β激活NF90转录，从而增加HIF-1α稳定，促进细胞增殖以及增强鼻咽癌细胞恶性表型。相反，也有lncRNAs通过表达下调来调控HIF的表达：例如HIF2PUT在骨肉瘤组织和细胞系中表达下调，从而上调HIF-2α表达，抑制细胞增殖与自我更新[11]。

1.2.2 细胞代谢最近的研究证明肿瘤相关巨噬细胞(tumourassociated macrophages，TAMs)通过包含lncRNA-HISLA的细胞外囊泡传递，增强乳腺癌细胞的有氧糖酵解和细胞抗凋亡能力。机制上，HISLA是通过阻断PHD2对HIF-1α的羟基化作用来抑制HIF-1α降解[12]。lncRNA-p21是一种乏氧应答基因，对乏氧诱导的糖酵解也有调控作用。lncRNA-p21能够同时结合HIF-1α和VHL，从而破坏VHL-HIF-1α交互作用，这种离解作用减弱了VHL介导的HIF-1α泛素化，造成HIF-1α的积累，形成HIF-1α/lncRNA-p21正反馈回路，进而促进乏氧环境下的糖酵解[5]。

1.2.3 侵袭和转移肿瘤的侵袭与转移是造成患者死亡的主要原因。研究结果表明BX111的过表达会增强胰腺癌细胞的增殖和侵袭，HIF-1α会诱导BX111的转录，BX111通过招募转录因子Y-box蛋白到启动子区域，激活ZEB1(EMT的关键调控因子)的转录，进而促进肿瘤的发展[13]。H19在恶性胶质瘤中表达同样较高，部分原因是HIF-1α上调特定蛋白1促使HIF-1α直接结合到H19的启动子上，从而诱导H19的转录激活。同时，H19还可以作为海绵连接miR-18d，激活β-catenin表达，参与乏氧驱动的胶质母细胞瘤细胞迁移和侵袭[14]。lncRNA-MTA2TR对HIF间接调控会促进胰腺癌细胞的转移，MTA2TR招募活化转录因子3到MTA2的启动子区域，转录上调MTA2的表达。MTA2可以通过脱乙酰作用稳定HIF-1α蛋白质，进一步激活HIF-1α的转录[15]。

2 HIF与microRNAs

microRNAs(miRNAs)是一类长度为20～25 nt的核苷酸双链，通过靶向mRNA特异性3′UTRs调节其表达，参与调控mRNA的翻译和稳定性[16]。近年来，关于miRNA表达调控、miRNA生物发生通路以及miRNA靶基因在乏氧环境中的调控已成为研究热点之一。

2.1 HIF与miRNA调控机制

肿瘤乏氧微环境下，HIF可以通过与miRNA启动子区域结合，直接调控miRNA的表达，miRNA表达的上调或下调，在肿瘤中可作为致癌基因或抑癌基因发挥作用。目前研究发现：乏氧环境下有大量下调的miRNA直接靶向HIF。如Xu等[17]发现miR-338-5p在结直肠癌(colorectal cancer，CRC)中呈显著下调，并证明HIF-3′UTR与miR-338-5p直接作用，触发HIF-1α/miR-338-5p/IL-6反馈循环，抑制miR-338-5p表达，在CRC中产生耐药性。同时，乏氧环境下miRNA也可以通过表达上调直接靶向HIF：肝癌酸性外泌体中HIF-1α通过与miR-21和miR-10b启动子区域的HREs结合，使其表达显著上调，促进肝癌细胞的增殖和侵袭，使病人不良生存率增加[16]。

HIF也可以通过其他乏氧转录因子如TWIST1、PPARγ与GATA1等间接调控miRNA的表达：HIF-1α通过调控TWIST1，上调miR-10b的表达，促进肿瘤转移[3]。miRNA也可通过控制VHL或PHD的表达来调控HIF-1α或HIF-2α的表达。miR-155在多种癌症类型中表达上调，在三阴性乳腺癌中其表达与VHL表达水平呈负相关，miR-155直接靶向VHL增加HIF-1α与HIF-2α水平[18]。miR-424特异性在血管重建的内皮细胞或缺血组织表达增加，直接靶向Cullin2(一种支架蛋白，是组装泛素连接酶复合物所必需的成分)从而阻止HIF-1α泛素化降解，促进血管生成，该过程与RUNX-1和C/EBPα的调控有关[19]。

2.2 miRNA与HIF在肿瘤中的作用

miRNAs/HIF在肿瘤中发挥着重要的调控作用，miRNAs可以影响肿瘤细胞致癌表型：如侵袭、转移、血管生成、耐药性等。以下综述了几种经典的miRNAs与HIF调控关系在肿瘤中的作用。

2.2.1 miR-210miR-210是一个乏氧关键调控因子，是HIF-1α的确定靶点，HIF-1α通过位于miR-210编码DNA的近端启动子上的HRE调节miR-210，并具有很强的靶向性。miR-210可以通过下调HIF-1α高羟基化，降低甘油-3-磷酸脱氢酶水平使HIF-1α蛋白水平稳定，发挥HIF-1α依赖于miR-210调控的正反馈环调节[19]。此外，miR-210还可通过靶向HIF-1α抑制剂如琥珀酸脱氢酶复合物亚基C/D(succinate dehydrogenase complex subunit C/D，SDHC/D)发挥反馈环功能，下调SDHC/D功能，以促进HIF-1α稳定[19]。miR-210/HIF-1α在大多数肿瘤乏氧环境中表达上调，特别是在胃肠道癌症中得到了大量文献证明，被认为是结直肠癌的生物标记物之一[20]。miR-210-3p是miR-210家族成员之一，被认为是DNA损伤修复机制和线粒体代谢的关键调节器，促进HIF的表达，对结肠癌化疗有耐药作用[21]。多发性骨髓瘤中，miR-210/HIF-1α信号轴可以增加VLA-4、CXCR4、IL6与TGF-β的mRNA表达，导致促成骨髓瘤细胞对左旋溶肉瘤素的耐药性[22]。在神经鞘瘤中，miR-210通过启动子去甲基化参与HIF-1α/VEGF介导的血管生成，增强肿瘤细胞增殖和自噬[23]。

2.2.2 miR-21miR-21是另一类在乏氧环境下受HIF-1α调节大量表达的miRNA，可以促进肿瘤细胞增殖、血管生成与侵袭。研究证明miR-21通过靶向PTEN并激活Akt和ERK1/2信号通路，导致HIF-1α与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达增加，诱导肿瘤血管生成[24]。因此，miR-21与HIF-1α的调控作用被认为可以增加肿瘤干细胞的干细胞特征，与肿瘤的恶性表型密切相关。另外，miR-21还可以通过Akt-mTOR信号通路在电离辐射后减少宫颈癌细胞的自噬，增加细胞的抗辐射作用[25]。肿瘤微环境细胞释放的外泌体中miRNA与肿瘤发病机制有关：miR-21在口腔上皮细胞鳞癌衍生外泌体中上调明显，可减少钙黏蛋白的表达，促进癌细胞迁移和侵袭[26]。肝癌酸性微环境与患者预后不良有关，酸性微环境会触发HIF-1α、HIF-2α的激活，并刺激外泌体中miR-21表达显著增加，促进癌细胞的增殖和转移。因此，miR-21可作为肝癌的预后分子标志物和治疗靶点。

2.2.3 miR-155 miR-155的启动子区域含有HRE序列，在许多肿瘤中表达上调。在结肠癌细胞乏氧环境下miR-155则会特异性减少HIF-1α的活性和表达，形成HIF-1α-miR-155负反馈回路从而维持氧稳态[3]。miR-155是炎症与癌症的重要中介，通过增强结合蛋白C/EBP-β信号级联参与巨噬细胞M1极化，与HIF共同调节巨噬细胞系细胞向肿瘤微环境的募集，促进肿瘤细胞生长、血管形成[27]。肿瘤微环境中的免疫细胞在肿瘤的进展和转移中起着重要的作用。miR-155通过调节巨噬细胞、树突状细胞、B细胞和T细胞的分化、成熟和活化，在先天免疫和适应性免疫中发挥重要作用。miR-155缺陷直接导致HIF表达上调，促进CXCL3、MDSCs与CXCL8等趋化因子的表达，使髓源性抑制细胞在肿瘤微环境大量募集，促进肿瘤发展[28]。

3 HIF与circRNA

circRNA是一类新发现的内源性非编码RNA，不具有5′末端帽子和3′末端poly A尾巴，并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子，是由非经典剪接方式进行反向剪接而形成的，circRNA具有保守稳定的结构，可以抵抗RNA降解途径。circRNA具有ceRNA的作用，作为“miRNA海绵”调控mRNA的表达。circPIP5K1A在非小细胞肺癌中表达明显下调，敲除circPIP5K1A后可以通过上调miR-600抑制HIF-1α表达，相反，过表达HIF-1α可以诱导EMT相关蛋白表达进而逆转miR-600的抗肿瘤效应。circPIP5K1A可通过miR-600的海绵作用发挥致癌基因作用，揭示了circPIP5K1A-miR-600-HIF-1α信号轴对治疗非小细胞肺癌的可能性[29]。在乏氧人脐静脉内皮细胞中，hsa_circ_0010729敲除明显抑制了细胞增殖、增强了细胞迁移能力与凋亡，miR-186可靶向hsa_circ_0010729和HIF-1α，抑制hsa_circ_0010729与HIF-1α表达发挥对血管内皮细胞增殖和凋亡的调控作用[30]。

4 小结与展望

ncRNAs与HIF之间的相互调控在肿瘤发生与发展过程中发挥着重要作用。ncRNAs在肿瘤或其外泌体中的异常表达现象，促使许多ncRNAs如miR-210、H19等被认为是潜在的治疗靶点和肿瘤生物标志物，在肿瘤诊断、治疗及预后中发挥重要作用。此外，以HIF相关ncRNAs作为潜在药物靶点，研究其模拟物或抑制剂也被认为颇具前景。然而，尽管已经报道了许多肿瘤相关的高通量数据，但由于有表达变化的ncRNAs的数量庞大，目前仅有少数ncRNAs的功能得到初步阐释，因此ncRNAs的研究仍处于初步阶段，如何高效挖掘有重要调节功能的ncRNAs与深化其分子机制已成为当前研究的热点和难点。

随着功能基因组学以及测序技术的不断发展，相信ncRNAs的功能及机制研究会更加深入，与此同时HIF对基因转录及转录后水平调节机制也会得到更加完善的阐释，为肿瘤诊断治疗与药物的研发提供新思路和新方案。