人源性肿瘤异种移植模型成瘤率影响因素的研究进展△

王月霞，吴晓林，秦贤举

江苏大学附属上海市第八人民医院胃肠外科，上海200235

肿瘤动物模型是肿瘤研究的重要工具，特别是将手术中获得的新鲜肿瘤组织移植到免疫缺陷小鼠使之成瘤的人源性肿瘤异种移植模型（patientderived human tumor xenograft models，PDX），弥补了传统体内模型丧失肿瘤微环境及原始肿瘤异质性的缺陷[1-4]。但PDX的平均移植成瘤率仅约为25%[5]，且各类肿瘤的成瘤率不等（23%～75%）[6]，因而限制了该模型的广泛应用。在这种类似于种植的建模操作中，肿瘤移植物、异种移植宿主及移植操作均是影响建模率的关键因素，本文针对上述3个方面就影响PDX成瘤率的因素作一综述。

1 移植物的特性及质量

1.1 移植物本身的特性

多种基于PDX的研究表明，接种病理分期较晚或转移灶标本的建模成瘤率更高[7-8]。但是，与其他肿瘤不同，胃癌的成瘤率与肿瘤的侵袭性及恶性程度无关[9-10]，这可能是因为胃癌的异质性高于其他肿瘤。目前，肿瘤患者在术前是否接受放化疗、肿瘤组织的病理类型及肿瘤标志物水平等对成瘤的影响尚存在争议；Fichtner等[2]在非小细胞肺癌建模中发现，病理类型、年龄、性别、吸烟史、术前是否放化疗等与建模成瘤率无关；而Marangoni等[8]在乳腺癌建模中发现，导管癌的建模成瘤率高于小叶癌，移植物来源的患者机体激素或受体水平与分泌相关性肿瘤的成瘤率密切相关，如雌激素受体（estrogen receptor，ER）阴性乳腺癌的成瘤率高于ER阳性乳腺癌。

1.2 移植物的质量

高质量的肿瘤移植物是种植的关键，且相对于移植物本身的特性，样本质量在一定程度上能够通过更严谨规范的操作来提高。移植物中肿瘤细胞数量及移植物热缺血时间是影响样本质量的两个关键因素。

Сhou等[4]注射到成功建立结直肠癌模型小鼠体内的肿瘤细胞明显高于失败组；弥散型胃癌建模较难成瘤是因为肿瘤细胞分散在基质组织中，在移植相同体积或数量的组织时，单位面积肿瘤细胞比例明显少于其他类型肿瘤[10]。因此，瘤源在移植前不仅需要去除坏死或被感染的细胞组织以避免动物因感染死亡，而且还需要确保移植物中肿瘤细胞的数量和比例，如Julien等[7]仅选取肿瘤细胞比例超过40%的样本用于后续建模。

此外，样本热缺血时间对成瘤也有显著影响，热缺血时间是指细胞、组织或器官从供体供血停止到冷灌注开始的这段时间。已有研究表明，缩短胃癌标本平均离体时间及建模操作时间可以明显提高建模成瘤率[10]，究其原因可能为离体组织血流中断后仍可以继续代谢，而堆积的代谢产物会影响成瘤。因此，在手术或活检后应快速建模或冰冻样本以缩短样本热缺血时间，而相关实验已经证明新鲜组织和冰冻组织的成瘤率并无明显差别[7,11]。

2 宿主的品系及特点

自Rygaard首次成功在裸鼠体内移植人源性肿瘤以来，免疫缺陷小鼠凭借其已知遗传信息、繁殖速度极快、解剖结构和基因组结构与人体极为相似且对移植物排斥反应小等优点成为肿瘤种植的最佳异种移植宿主。

动物存在免疫缺陷但却并非没有免疫力，其体内残存的免疫细胞对移植物的筛选及排斥作用明显影响成瘤效果，因而应用免疫缺陷度更高的小鼠品系代替裸鼠可以明显提高建模成瘤率[10,12]。但宿主免疫力过低会导致死亡率增高[13]，且免疫缺陷程度更高的NOD/SСID及NOG品系在建模中易发生人源性淋巴瘤，这在肝癌[14]、非小细胞肺癌[15]、肠癌[16]等肿瘤建模中均有报道，尤其常见于胃癌[10,17]建模中；究其原因可能是因为胃癌患者通常伴有幽门螺旋杆菌感染，移植后在无免疫监视的小鼠体内激活扩增，进而刺激人源性B淋巴细胞转化为恶性增殖状态[17]，这提示裸鼠可能更适宜作为胃癌PDX模型的接种对象。

此外，部分激素依赖性肿瘤，如乳腺癌、前列腺癌等，还需要考虑小鼠的性别和激素水平，如在乳腺癌建模中给雌鼠补充雌激素是提高成瘤率的有效方法[18]。鼠龄也是影响成瘤的一个因素，与年幼（3周龄）或新生鼠相比，成年鼠（6～8周龄）更易成瘤及转移，这可能与不同年龄小鼠中NK细胞的活性有关[19]。上述研究显示，最佳移植宿主的选择应根据肿瘤类型、操作要求等具体分析，综合考虑。

3 移植的方法及部位

3.1 移植的形式及方式

根据肿瘤类型及研究目的，可以将移植物以组织块或细胞悬液的形式接种到小鼠体内，实体瘤通常以组织块的形式接种，而血液恶性肿瘤以细胞悬液的形式注射。同时，也可根据研究目的将实体瘤制备成细胞悬液注射到鼠尾静脉，以模拟肿瘤血道转移；或通过细胞表面特异性标志物分选单类细胞，再注射到小鼠体内以探究各类细胞的功能等。Al-Hajj等[20]将从乳腺癌患者恶性胸腔积液中分类出的人上皮特异性抗原（epithelial specific antigen，ESA）阳性细胞注射到小鼠体内，随后发现了乳腺癌肿瘤干细胞。

同一组织块的接种方式对成瘤率也有一定影响。直接缝合能够从整体上观察成瘤，是一种可靠有效的观察模型；医用胶粘手术难度小，操作时间短，且吻合度好，也避免了因扎到肠壁血管而造成肠坏死的缺点，降低了手术死亡风险[21]；用穿刺针穿刺后以扩大针眼的方式代替皮肤切开，不仅缩短建模时间，还减少了肿瘤生长过程中小鼠搔抓破裂的概率[22]。同样，细胞悬液浓度、混匀液体种类及细胞悬液中细胞状态对成瘤率也有明显影响。每点注射细胞越多，越易成瘤，但高浓度悬液会给实验操作带来较大难度[18]，这就需要通过预实验调整悬液浓度，保证在较顺利的操作下尽可能提高成瘤率；混匀液体的选择取决于研究的目的，如选择鼠尾胶可以增加细胞间黏附，应用基质胶可以使移植物免于局部免疫效应细胞的攻击[23]；悬液中细胞的状态对成瘤的影响相对关键：细胞簇比单细胞悬液更易成瘤并明显增加肿瘤的转移能力[23-24]。

3.2 移植部位

根据瘤源在小鼠体内接种部位的不同，可以将移植模型分为异位和原位移植模型。皮下移植是异位移植最常见的部位，也是较大规模接种的首选方式。研究表明，多种肿瘤的皮下移植成瘤率高于其他部位[4,8,10]，且皮下成瘤的体积更大、小鼠早期的发病率及病死率也更低。肾包膜下因其良好的血供及独特的流体动力学为异位移植提供了新思路。Lin等[25]在肾包膜下建立的前列腺癌PDX模型的成瘤率达94%，且可连续传代培养。然而，任何部位的异位移植都改变了肿瘤生物学行为和自然属性，因而应尽可能地建立更接近人体的肿瘤生长模式的原位移植模型，但这也对操作技术、研究经费、观测手段等有着更高的要求。

移植部位的选择应根据肿瘤类型、研究目的及操作条件等综合考虑，使各部位接种优点最大化。即使同为原位或异位移植，移植部位稍有差异也可能影响成瘤，如结直肠癌标本原位移植到远端、近端结肠及直肠的成瘤也不同[7]；同为皮下接种，移植到近头侧的成功率更高，接种到腋窝等皮肤松弛部位能使肿瘤长的更大[19]。针对同种肿瘤，若研究肿瘤免疫遗传或抗肿瘤药物的初步筛选，可以选择成瘤率更高的异位移植模型；若研究肿瘤发生发展及转移的机制，则应尽可能地建立与人体更接近的原位移植模型。

4 小结

PDX模型成瘤率是多因素共同作用的结果，除上述几个报道较多、认识较明确的因素外，可能有部分原因尚未明确，这就需要研究人员在基于PDX模型的研究中全面综合分析，使影响成瘤率的各个因素达到最佳组合，并在实验中不断总结经验，尽力探究更多未知的影响因素，使肿瘤模型取得更理想的成瘤率，进而基于模型开展后续研究。此外，还要熟练掌握实验技术，关注免疫缺陷动物学发展，减少操作引起的实验动物死亡。

除成瘤率低外，成本高、建模时间长，移植物中人源性基质随传代会逐渐丢失等缺点也限制了该模型的广泛应用。但这也为生命学科的研究者提供了新方向与新挑战，从而不断完善改进建模技术，争取在肿瘤研究领域建立PDX模型数据库，将患者特征、肿瘤特点、分子结构、药理反应等与动物模型互联，为高度复杂多样的肿瘤建立更细化的分层，最大程度凸显肿瘤异质性。从而在短时间内高效搜索，为每例患者寻找最适合的个性化精准医疗。