马立克氏病病毒贵州株meq基因的克隆及遗传进化分析

张喜懿， 温贵兰*， 欧德渊， 陈 广， 张小波， 汪德生， 文 明， 胡 璇， 孙 芸， 刘蔓蔓

(1. 贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025； 2. 贵州省动物生物制品工程技术研究中心，贵州 贵阳 550016)

马立克病(Marek’s disease，MD)是由马立克病病毒 (Marek’s disease virus，MDV)引起鸡的1种淋巴组织增生性疾病，其特征是病鸡的外周神经、虹膜、各内脏器官形成肿瘤病灶[1]。Josebp Marek于1907年首次报道该病，Campbell J G等1961年正式将该病命名为鸡马立克氏病[2]。Churchill A E等[3]1967年首次从接种病鸡细胞的培养物中分离出MDV。此后世界各地相继报道有马立克病的发生和流行，给养禽业造成严重的经济损失[4]。MDV共有3种血清型，即血清1型(MDV-1)、血清2型 (MDV-2)、血清3型 (MDV-3)，但只有MDV-1可致瘤或致病[5]。根据MDV-1致病性的强弱，又可将其分为温和型(mild MDV，mMDV)、强毒型(virulent MDV，vMDV)、超强毒型(very virulent MDV，vvMDV)、特超强毒MDV(very virulent plus MDV，vv+MDV)[6]。相关研究表明，与MDV致肿瘤相关的基因有meq、132-bpr、pp38/pp24、v-IL8等，而132-bpr基因与Meq基因是MDV-1所特有的，其中meq基因是公认的主要致瘤基因，与MDV-1强弱毒株致瘤性的不同有关[7，8]。本试验从疑似MD贵州矮脚黄鸡的肝脏病料中扩增出MDVmeq基因片段，并对该片段进行克隆及遗传进化分析，为丰富贵州省MDV毒株信息库及防控MD提供参考。

1 材料

1.1 检测病料肝脏病料采自贵阳市某养殖场饲养的疑似MD矮脚黄鸡，保存于贵州大学预防兽医学实验室(-80 ℃冰箱)。

1.2 主要试剂琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、病毒基因组DNA/RNA 提取试剂盒[购自天根生化科技(北京)有限公司]，HiFi-Script cDNA第一链合成试剂盒(购自康为世纪生物科技有限公司)，质粒提取试剂盒、2×ESTaqDNA Mix、pMD19-T Vector、DL 2 000 DNA Marker、DL 5 000 DNA Marker[购自宝生物工程(大连)有限公司]，大肠杆菌DH5α感受态细胞(购自上海碧云天生物技术有限公司)。

1.3 主要仪器电泳槽(DYCZ-HOB型)、电泳仪电源(DYCZ-8C型)(购自北京市六一仪器厂)，SYGENE电泳凝胶成像仪(购自GENE公司)，多功能梯度PCR仪(VeritiTm 96-Well Thermal Cycler)(购自ABI公司)，37 ℃隔水式电热恒温培养箱(BD53)(购自BINDER公司)。

2 方法

2.1 引物信息参考GXY2株meq基因(GenBank登录号：EF546430)设计MDVmeq，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物信息见表1。

表1 引物信息

2.2 MDV核酸PCR检测根据病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书分别提取总DNA和总RNA，再根据HiFi-Script cDNA第一链合成试剂盒将总RNA反转录为cDNA备用。使用MDVmeq特异引物对核酸样品进行PCR扩增。总反应体系20 μL：上、下游引物(10 mol/μL)各1.0 μL，2×ESTaqDNA聚合酶10 μL，核酸2 μL，ddH2O 6 μL。反应条件：94 ℃ 预变性2 min；94 ℃ 变性45 s，60.3 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；72 ℃再延伸10 min。PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶中电泳检测。

2.3 MDVmeq基因克隆将MDVmeq的PCR产物进行胶回收，连接到pMD19-T载体，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化细胞接种于LB固体培养基，37 ℃培养箱中倒置培养16～24 h至长出菌落，挑取6个单菌落接种于含氨苄青霉素(50 mg/mL)的LB液体培养基，于37 ℃ 170 r/min培养12～16 h。取培养的克隆菌液2 μL进行PCR鉴定(反应体系及条件同2.2)，提取阳性克隆菌液质粒送华大基因测序。

2.4 MDVmeq基因遗传进化分析将测序结果与GenBank中已有序列进行比对，利用MegAlign软件分析其同源性、氨基酸缺失位点，并构建遗传进化树。参考毒株信息见表2。

表2 MDV meq基因参考毒株信息

3 结果

3.1 MDV核酸检测结果由图1可见：经PCR扩增，于1 020 bp处出现MDVmeq基因特异扩增条带，长度与预扩增片段相符，表明病鸡存在MDV感染，将该片段命名为MDV GZ 2019meq。

3.2 MDVmeq基因克隆菌液PCR鉴定结果由图2可见：各克隆菌液在1 020 bp处均出现特异扩增条带，与目的基因大小相符。

3.3 MDV GZ 2019meq基因同源性分析测序结果显示MDV GZ 2019meq基因全长1 020 bp，共编码339个氨基酸，将其与GenBank登录的10株MDV参考株的meq基因进行核苷酸序列、推导氨基酸序列同源性比对。由图3可见：MDV GZ 2019meq基因与参考毒株的核苷酸同源性为98.7%～99.8%。其与国内特超强毒MDV分离株GXY2株的同源性最高(99.8%)，与国内强毒MDV分离株J-1株、美国特超强毒MDV分离株648A株的同源性最低(98.7%)。由图4可见：MDV GZ 2019meq基因与参考毒株的推导氨基酸同源性为96.7%～99.4%。其与国内特超强毒MDV分离株GXY2株的同源性最高(99.4%)，与荷兰温和型MDV分离株CVI988株的同源性最低(96.7%)。

3.4 MDV GZ 2019meq基因核苷酸序列遗传进化树分析由图5可见：MDV GZ 2019meq基因与国内特超强毒MDV分离株GXY2株的亲缘关系最近，与美国特超强毒MDV分离株TK株、N株、648A株的亲缘关系最远。

3.5 MDV GZ 2019meq基因推导氨基酸序列分析将MDV GZ 2019meq基因推导氨基酸序列与GXY2等10株参考毒株进行比对，发现共有5个突变位点，分别为第63位(R→G)、第80位(D→Y)、第139位(T→A)、第176位(P→R)、第217位(P→A)(见图6)。除第63位氨基酸突变是MDV GZ 2019meq基因所独有以外，其余突变位点与国内特超强毒MDV分离株GXY2株完全一致。

4 讨论

4.1meq基因是MDV-1中特有的主要致肿瘤基因，关于该基因的国内外报道较多，但其致瘤机制目前仍不清楚[9]。meq基因相对保守，在不同致病力毒株之间其核苷酸和氨基酸序列的同源性均较高。本试验中MDV GZ 2019meq基因的核苷酸、推导氨基酸同源性分析结果表明，其与10株不同致病力MDV参考毒株的核苷酸序列和推导氨基酸序列同源性分别为98.7%～99.8%、96.7%～99.4%。强毒株MDVmeq基因全长1 020 bp，编码339个氨基酸；而疫苗弱毒株(如CVI988株、814株)的meq基因在第575～577位有3个碱基缺失(即CAC)，导致了1个脯氨酸的缺失[10]。本试验分离的MDV GZ 2019meq基因长度为1 020 bp，在第575～577位不存在碱基缺失，与大部分强毒株的特性一致，说明其具有强毒株的特征。

4.2相关文献报道，低致病力MDV毒株具有脯氨酸重复区，而强毒株第153位、176位、217位的脯氨酸存在突变，破坏了meq基因原有的脯氨酸重复区，导致了致病力的变化[11]。本试验中MDV GZ 2019meq基因共有5个氨基酸突变位点，分别在第63位(R→G)、第80位(D→Y)、第139位(T→A)、第176位(P→R)、第217位(P→A)，其中第176位和217位氨基酸的突变破坏了脯氨酸重复区，具有强毒株特性；此外，除第63位氨基酸突变是MDV GZ 2019meq基因所独有以外，其余突变位点均与国内特超强毒MDV分离株GXY2株完全一致，故推测其为强毒株。

5 结论

本试验从疑似MD贵州矮脚黄鸡的肝脏病料中扩增出MDVmeq基因，并进行克隆及序列分析，发现该基因长度为1 020 bp，可编码339个氨基酸；与国内特超强毒MDV分离株GXY2株的核苷酸序列同源性高达99.8%；存在5个氨基酸突变位点，除第63位突变是MDV GZ 2019meq基因所独有以外，其余突变位点均与国内特超强毒MDV分离株GXY2株完全一致，推测其为强毒株，具体致病性强弱还需进一步研究。