细胞迁移显微图像自动检测初探

齐丹丹 郭占欣

摘  要：目的 针对细胞迁移的实验结果处理需求，设计了一种操作简单的细胞图像自动检测分析系统。方法 体外环境下设计细胞模型，使組蛋白甲基转移酶EZH2在肺腺癌细胞A549中的表达呈现4种表达状态，使用transwell小室实验分别检测细胞迁移能力相应的变化，比较人工计数与自动检测分析系统的结果。结果 EZH2表达下降会导致细胞迁移数目的减少，降低细胞迁移的能力。结论 对比分析传统人工计数与自动检测分析系统的结果，自动计数的方法有效可靠。

关键词：细胞迁移;细胞图像;自动计数

中图分类号：TP391 文献标志码：A       文章编号：2095-2945（2020）26-0072-02

Abstract： Objective： To design a simple automatic detection and analysis system for cell migration. Methods： The cell model was designed in vitro， and the expression of histone methyltransferase EZH2 in human lung adenocarcinoma cell line A549 showed four expression states. Transwell assay was used to detect the corresponding changes of cell migration ability， and the results of manual counting and automatic detection and analysis system were compared. Results： The decrease of EZH2 expression would decrease the number of cell migration and the ability of cell migration. Conclusion： The method of automatic counting is effective and reliable by comparing and analyzing the results of traditional manual counting and automatic detection and analysis system.

Keywords： cell migration; cell image; automatic counting

引言

细胞迁移是细胞的基本功能之一，是研究肿瘤细胞转移常用的方法之一。细胞转移会导致肿瘤疾病的恶化，增加肿瘤治疗的难度，因此肿瘤细胞的转移是临床医学中研究的热点及难点[1，2]。在人体中有多个基因与肿瘤的发生转移相关，其中1996年Hobert等人发现了EZH2基因，该基因可能参与了细胞迁移等一系列肿瘤发生发展的过程[3]。其编码形成的组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶EZH2在多种肿瘤细胞中呈现高表达的状态，表达状态的高低与肿瘤细胞的恶性程度密切相关，即与细胞迁移等细胞功能密切相关。由此，EZH2可能成为肿瘤治疗过程中的潜在作用靶点。

本文在体外环境下，利用Transwell小室实验检测不同EZH2表达量对于肺癌细胞A549迁移能力的影响。目前对于实验结果的统计方法大都使用人工测量的方式，这种方式的结果具有较强的主观因素，对于精密的实验结果影响较大，并且实验结果的处理会耗费大量时间和精力。现有的细胞图像处理软件需要实验人员具备一定的图像处理专业知识，增加实验人员的负担和实验结果的不确定性。基于此，笔者开发了显微细胞图像一键操作模式下的自动量化分析系统，实现细胞自动计数。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

人肺腺癌细胞株A549（中科院上海细胞研究所细胞库）;RPMI-1640培养基（规格：500ml，青霉素的含量为100U/ml，链霉素的含量为100ug/ml）购于天津鼎国生物公司;胎牛血清（FCS）购自Gibco公司;抗体包括ZH2单克隆抗体（兔源）、β-actin单克隆抗体（鼠源）、H3K27me3单克隆抗体（鼠源）、兔二抗的抗体以及鼠二抗的抗体;Transwell实验中所用transwell小室，规格直径为8μm，购自美国的Corning公司，染料为0.5%的结晶紫染料。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

人肺腺癌细胞株A549是贴壁型细胞的一种，使用RPMI-1640培养基进行培养，培养基中加入10%胎牛血清。在温度为37℃和5%CO2的恒温细胞培养箱中进行培养，两到三天进行一次传代。

1.2.2 细胞模型建立

使用EZH2的酶活性抑制剂GSK126刺激A549细胞，浓度分别为0μM、5μM、10μM、20μM。在24h后用Western Blot实验验证EZH2的表达效果（图1）。

1.2.3 Transwell实验

首先要将A549细胞进行饥饿培养，24h后进行铺种。细胞消化收集后将其接种于24孔培养板transwell小室的上室中，接种密度为1×106个/ml，体积为200μl，transwell的下室加入600μl 的RPMI-1640完全培养基。上下室之间形成的培养基浓度差对细胞产生趋化作用，使具备迁移能力的A549细胞能够透过小室上的滤膜贴在小室的下壁上生长。在上下室均加入等浓度的抑制剂GSK126进行药物刺激48h后取出，加入结晶紫染色溶液染色后显微镜下成像计数。选取“上下左右中”5个视野点显微镜下采集图像，统计5个区域中细胞数目的平均值，将其记录为相应抑制剂浓度下的细胞迁移数。本实验重复3次，取其平均值作为实验结果。

1.2.4 实验结果统计

（1）人工统计：对5个视野点的显微图像进行人工计数，为了保证实验结果的可靠性，计数过程中要对细胞图像进行统一标准的计数，尽量避免人工计数的准确性和主观性。

（2）软件测量：自主设计针对显微图像的自动检测分析系统，细胞图像输入自动检测系统后，无需实验者进行图像预处理，系统结合距离变化与分水岭算法，自动完成细胞图像的分割识别与计数，实现一键操作。

显微图像软件测量的设计分为三个部分：第一，图像预处理。采用高斯滤波以及形态学算法去除显微图像的噪声干扰，增加图像的对比辨識度。使目标区域与背景区域差别增大，有利于目标的识别计数;第二，显微图像预分割。图像的初步分割使用K聚类均值，有效的区分图像的背景和目标区域，而后应用去除小区域步骤消除不是细胞的干扰目标;第三，显微图像精细分割。使用欧式距离的变换方式，对预分割的显微图像形成种子标记图，而后借助分水岭算法的概念分割粘连细胞，准确地计数显微图像的细胞总数。

1.2.5 实验结果统计学分析

进行三次重复实验，计算三次实验的平均值和标准差，使用SPSS软件的方差分析对实验结果进行显著性差异分析，将人工技术的结果作为标准，分析自动测量软件的准确性。

2 结果

2.1 实验结果一

使用自动测量软件计数显微图像中的细胞数目，统计学运算得到实验组和对照组之间的数据具有显著性的数据差异（P<0.05），因此根据实验结果可以得到EZH2表达下降会导致细胞迁移数目的减少，减弱细胞迁移的能力，对肿瘤恶化的抑制至关重要。

2.2 实验结果二

以人工计数结果作为标准，分析自动检测软件的准确率，对比结果如表1所示。统计结果显示自动计数的准确率达到93%。相较而言，自动计数消除人工计数的人为主观性，减少实验结果处理的实践，实验结果较为准确。

3 结束语

本文在建立细胞模型的基础上，检测了EZH2表达变化对细胞迁移的影响，对显微图像自动计数，极大程度上方便了实验者的使用，避免实验者耗费时间精力学习图像处理专业知识，达到结果的自动定量分析。

参考文献：

[1]李广灿，叶召.全球常见恶性肿瘤的当前流行趋势[J].肿瘤防治研究，1999，26（4）：308-312.

[2]Chen YT， Zhu F， Lin WR， et al. The novel EZH2 inhibitor， GSK126， sup-presses cell migration and angiogenesis via down-regulating VEGF-A[J]. Cancer Chemotherapy & Pharmacology， 2016：1-9.

[3]Hobert O， Jallal B， Ullrich A. Interaction of Vav with ENX-1， a putative transcriptional regulator of homeobox gene expression[J]. Molecular & Cellular Biology， 1996，16（6）：3066-3073.