A型肉毒素对带状疱疹后神经痛小鼠炎性神经递质表达的影响

李国松，汤样华，徐灿达，沈志恩，林成英

（杭州市萧山区中医院 疼痛科，浙江 杭州 311200）

带状疱疹后神经痛（postherpetic neuralgia，PHN）是带状疱疹皮损愈合后遗留的顽固性神经病理性疼痛，是带状疱疹最常见的并发症之一[1]。流行病学调查显示，约有20%的带状疱疹患者在发病后3个月有PHN发生，且发生率随年龄而增长，60岁以上老年患者发生率高达50%～75%[2-3]。PHN一旦形成，由于疼痛较为剧烈，且病程长，患者多伴有焦虑和抑郁等精神症状，严重影响患者生活质量。目前临床上治疗PHN的方法主要分为药物疗法和非药物疗法。治疗药物主要有抗抑郁药、抗癫痫药、镇痛药等，需要长期甚至终身服药，且不良反应较多。非药物疗法如脊髓电刺激、神经阻滞与毁损、皮内注药疗法等有严重并发症的可能，且部分疗法因临床患者个体差异而导致安全性和有效性不尽人意。近几年来，有研究报道[4]应用A型肉毒毒素（botulinum toxin A，BTX-A）皮下注射可有效地治疗PHN。BTX-A是肉毒杆菌在繁殖中分泌的一种有毒性的蛋白质，可通过阻断神经递质在突触前膜的释放，以减轻神经病理性痛[5-6]。但关于BTX-A治疗PHN的作用机制尚不明确。前期研究中我们已通过微量加样器皮下接种注射I型单纯疱疹病毒成功建立了PHN小鼠模型，本研究旨在通过观察BTX-A对PHN小鼠模型炎性神经递质表达的影响，探讨BTX-A对PHN的作用机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器 BTX-A（兰州生物制品研究所，国药准字号S10970037，生产批号20170928），RNeasy Mini RNA抽提试剂盒（德国Qiagen公司），Quant Reverse Transcriptase反转录试剂盒（美国Bio-Rad公司），SYBR Green荧光素酶（美国Thermo Scientific公司），小鼠TNF-α、IL-1β、NKA（英国Abcam公司），NE-PER蛋白提取试剂盒（美国Thermo Scientific公司），抗Na1.3 鼠单克隆抗体（英国Abcam公司），抗Na1.8鼠单克隆抗体（英国Abcam公司），抗β-Actin鼠单克隆抗体（美国Sigma公司）。BECKMANDU800紫外分光光度计（美国Beckman公司），GIS凝胶图像处理系统（日本Olympus公司），Rotor Gene 3000荧光PCR仪（美国Rotor Gene公司），DENLEY DRAGON Wellscan MK 3酶标仪（美国Thermo Scientific公司），Wellwash 4 MK2洗板机（美国Thermo Scientific公司），PYX-DHS恒温培养箱型（上海跃进医疗器械厂），TGL-168离心机（上海安亭科学仪器厂），移液枪（美国Thermo labsystems公司），Odyssey红外成像系统（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 PHN动物模型的制作:选择SPF级8周龄雄性C57小鼠，体质量18～22 g[由上海中医药大学实验动物中心提供，实验动物许可证号SCXK（沪）2003-0003]，腹腔内注射1%戊巴比妥钠溶液50 mg/kg麻醉后，将左下肢和背部用化学脱毛剂脱毛并用清水冲洗脱毛部位。3 d后，选取脱毛区光滑无损伤动物进入以下实验，皮肤损伤的动物剔除。分别于每只动物左下肢胫骨局部处用微量加样器皮下接种I型单纯疱疹病毒（HSV-1）10 μL（浓度1×106PFU/mL），于接种前和接种后第1、第3、第5、第7天测定后爪机械痛阈和热痛痛阈反应评分，鉴定PHN动物模型是否造模成功。

1.2.2 动物分组与药物干预:选择造模成功的PHN小鼠36只，随机分成A、B、C 3组，每组12只。A组在疱疹部位注射0.9%氯化钠溶液；B组在疱疹部位注射BTX-A（2 U/kg）；C组在L5背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）处注射BTX-A（2 U/kg）。每天1次，连续干预7 d。

1.2.3 实验标本取材:注射BTX-A后第7天，所有小鼠全部腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥钠麻醉后，剪开胸腔，暴露心脏，从心尖插入灌注针至左心室，用止血钳固定针尖，并剪开右心耳形成灌注液排出管道，从左心室快速灌注37 ℃ 0.9%氯化钠溶液，直到从右心耳流出的液体为无色，同时小鼠肝脏色淡，肠管肿胀为止，停止灌流。迅速暴露左侧坐骨神经，然后剪开骨质，逆行找到相应的L5 DRG并取出，立即置于液氮中备用。再逆行找到相应的发出神经的术侧脊髓节段并取出，立即置于液氮中备用。

1.2.4 RT-qPCR反应检测小鼠DRG和脊髓中炎性神经递质TNF-α、IL-1β、神经激肽A（neurokinin A，NKA）的mRNA表达:从液氮中取出DRG和脊髓标本，分别按照试剂盒说明书抽提总RNA。用紫外分光光度计选择波长260 nm和280 nm分别检测OD值，测得样本OD260/280为1.6～2.0后进行反转录和扩增。按照反转录试剂盒说明书将总RNA反转录成cDNA，然后进行Real-time PCR反应。引物由大连宝生物公司设计、合成。引物序列见表1。

1.2.5 ELISA法检测小鼠DRG和脊髓中炎性神经递质TNF-α、IL-1β、NKA的蛋白表达:具体操作步骤分别按照试剂盒说明书进行，用酶标仪在450 nm下，测定显色物的OD值，OD值反映了底物被水解的量。根据试剂盒提供的标准品（已知浓度）对应的酶含量绘制标准曲线，计算获得测试样品中相应抗体的浓度。

表1 Real-time PCR反应引物序列

1.2.6 Western blot检测各组小鼠DRG和脊髓中Na1.3、Na1.8 通道蛋白表达:蛋白裂解液裂解组织，离心后，取上清液。收集完蛋白样品后，用蛋白浓度测定试剂盒测定每个蛋白样品的蛋白浓度，以含30 μg蛋白计算需要的上样体积，确保每个蛋白样品的上样量一致。加入适量上样缓冲液，沸水中蛋白变性5 min，4 ℃冷却。安装好电泳槽，按照蛋白分子量不同，预制5%浓缩胶和8%分离胶，加入蛋白样品及蛋白marker 5 μL左右。先80 V电压跑浓缩胶，然后110 V电压跑分离胶。电泳至蛋白marker目的条带区域分离开，停止电泳。300 mA恒流，80 min转膜。将PVDF膜放入封闭液中冰上摇1 h。后加入稀释好的β-actin（1:5 000）及Na1.3（1:1 000，5%奶粉/TBST配制）、Na1.8抗体（1:1 000，5%奶粉/TBST配制）冰上摇1～2 h，再转入4 ℃冰箱过夜。TBST洗膜2次，冰上摇10 min。加入1:10 000的二抗，孵育1 h。将二抗倒去，用PBS清洗3遍，Odyssey红外成像系统采集目的条带图像。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS19.0软件对数据进行分析处理。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠DRG和脊髓中炎性神经递质RT-qPCR检测结果 与A组比，B组和C组炎性神经递质TNF-α、IL-1β、NKA的mRNA相对表达水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），但B和C组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.2 小鼠DRG和脊髓中炎性神经递质ELISA法检测结果 与A组比，B组和C组TNF-α、IL-1β、NKA的蛋白含量显著降低，差异有统计学意义（P ＜0.05），但B和C组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

2.3 小鼠DRG和脊髓中Na1.3、Na1.8通道蛋白的Western blot检测结果 与A组比较，B组和C组Na1.3、Na1.8通道蛋白表达显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），但B和C组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4和图1。

表2 各组小鼠DRG和脊髓中炎性神经递质RT-qPCR检测结果（每组n=12）

表3 各组小鼠DRG和脊髓中炎性神经递质ELISA法检测结果（每组n=12）

表4 各组小鼠DRG和脊髓中Na1.3、Na1.8通道蛋白相对表达量（每组n=12）

图1 各组小鼠DRG和脊髓中Na1.3、Na1.8通道蛋白Western blot检测结果

3 讨论

国内外研究[7-9]发现，目前临床上应用BTX-A治疗PHN，镇痛效果明显，是一种潜在的可能用于治疗PHN的可靠方法，但是作为一种运动神经的特异性阻滞剂，BTX-A治疗PHN的内在机制仍不清楚，因此，仍需要大量的基础及临床研究来揭示BTX-A治疗PHN的作用机制，以更准确和更有效地指导临床治疗。研究[10-11]表明，带状疱疹患者发生PHN的一个重要原因为其周围神经干发生炎症，神经末梢释放大量的P物质、NKA、炎性因子等介质，使患者对伤害性刺激更加敏感，引起周围神经敏化，产生疼痛症状。本研究采用RT-qPCR和ELISA法检测了小鼠DRG和脊髓中相关炎性神经递质TNF-α、IL-1β、NKA的mRNA和蛋白表达量。结果表明，于疱疹局部注射BTX-A和L5 DRG注射BTX-A（2 U/kg）均可显著降低TNF-α、IL-1β、NKA的mRNA和蛋白表达水平，与局部注射0.9%氯化钠溶液组比较，差异有统计学意义，提示BTX-A治疗PHN的作用与抑制炎性神经递质TNF-α、IL-1β、NKA的mRNA和蛋白表达水平相关。

另外，有研究通过检测水痘带状疱疹病毒感染后的大鼠DRG，发现神经肽表达显著增加，钙通道、钠通道1.3和1.8蛋白显著激活[12]。本研究中通过Western blot检测小鼠DRG和脊髓中Na1.3、Na1.8通道的蛋白表达发现，BTX-A可显著降低Na1.3、Na1.8通道的蛋白表达，且与0.9%氯化钠溶液对照组比较差异有统计学意义，也进一步提示，BTX-A治疗PHN的作用可能与降低通道蛋白Na1.3、Na1.8的表达相关。

综上所述，结合本研究结果表明，BTX-A能有效抑制PHN，其作用机制可能是通过降低通道蛋白Na1.3、Na1.8 的表达，抑制炎性神经递质TNF-α、IL-1β、NKA的mRNA和蛋白表达水平。但在本研究中实验结果发现局部注射BTX-A和L5 DRG注射BTX-A，对PHA小鼠炎性神经递质表达的影响差异无统计学意义，从而表明注射部位对于BTX-A治疗PHA的机制影响不大，其可操作性方面及临床应用方面尚需进一步研究。