人结直肠癌组织CD4+、CD8+ T淋巴细胞与患者预后的关系

傅超，梅婷婷，汪鸿涛，陶勇，王东，裘建明，杨关根

（1.浙江中医药大学附属杭州第三医院 肛肠外科，浙江 杭州 310009；2.宁波市第一医院 肛肠外科，浙江 宁波 315000）

结直肠癌是常见的高度恶性的消化道肿瘤之一，在世界范围内致死率依然居高不下[1]。诊断时常已是中晚期，预后不佳。因此，找到新的肿瘤标志物及时发现预后不良高危患者，一直是研究的热点与难点。研究证实肿瘤浸润T淋巴细胞（tumourinfiltrating T lymphocytes，TILs）可改变肿瘤微环境，参与或抑制恶性肿瘤细胞的增殖和迁移[2]。目前发现CD4+、CD8+T淋巴细胞已在肝癌[3]、卵巢癌[4]、胰腺癌[5]、膀胱癌[6]等实体恶性肿瘤存在差异性改变，并可预测其预后，但对于结直肠癌预测研究的报道甚少。因此，本研究探讨分析CD4+、CD8+T淋巴细胞水平与结直肠癌患者临床病理特征及其预后的关系，并评价其作为一项预后标志物的可能性。

1 对象和方法

1.1 对象 入选标准:①所有患者均初次接受标准化结直肠癌手术治疗；②术后病理确诊为结直肠癌，且根据AJCC第7版TNM分期标准；③未接受其他任何靶向抗肿瘤、新辅助放化疗等治疗；④排除各种免疫系统疾病如血液病等；⑤排除合并其他恶性肿瘤患者。根据上述标准，收集2012年1月至2014年1月浙江中医药大学附属杭州市第三医院肛肠科收治的行手术切除并经病理证实的109例结直肠癌患者临床病理资料及术后标本。其中男71例，女38例，年龄32～78岁。本研究经本院伦理委员会通过，患者或其家属签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂:鼠抗人CD4+单克隆抗体（购自美国Chemicon公司）；鼠抗人CD8+单克隆抗体（购自武汉博士德生物工程有限公司）；抗鼠IgG抗体（购自北京中杉金桥生物技术有限公司）；免疫组织化学试剂盒及DAB显色试剂盒（购自武汉博士德生物工程有限公司）。

1.2.2 免疫组织化学检测:①109例结直肠癌组织标本经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片厚5 μm，经常规脱蜡水化，枸橼酸缓冲液高温修复抗原。以0.3%过氧化氢-甲醇孵育10 min，以阻断清除内源性过氧化物酶。PBS漂洗4次滴加5% BSA封闭液，室温孵育60 min，倾去。滴加一抗1:50鼠抗人CD4+、CD8+单克隆抗体，4 ℃冰箱孵育过夜，PBS漂洗后。再滴加二抗抗鼠IgG抗体，室温孵育20 min，PBS漂洗。DAB显色15 min，苏木素复染，脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，PBS代替一抗作阴性对照。②结果判读:通过光学显微镜（德国Olympus公司）分析特定免疫细胞染色浸润的程度。CD4+、CD8+T淋巴细胞的量化标准:肿瘤组织中上皮细胞浸润＞5%为高表达，浸润≤5%为低表达，CD4+/CD8+为两者同时高表达。

1.3 随访计划 采用门诊或电话对所有患者进行为期5年的随访，截止时间为2019年1月。随访研究的主要终点是无病生存率（disease-free survival，DFS），定义为从手术之日起至第1次出现局部或者区域复发转移、随访终止或死亡时间；总生存率（overall survival，OS），定义为手术之日至出现任何原因引起的死亡时间或随访终止。

1.4 统计学处理方法 采用SPSS17.0软件进行统计学分析。应用Pearson χ2检验或Fisher精确概率法对2组患者之间临床病理特征进行比较。采用Kaplan-Meier分析方法绘制生存曲线，Log-rank检验比较分组生存率的差异。运用Cox回归模型进行单因素及多因素预后分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤浸润CD4+、CD8+T淋巴细胞水平及分组免疫组织化学结果显示，CD8+T淋巴细胞浸润高水平78例，低水平31例；CD4+T淋巴细胞浸润高水平56例，低水平53例，见图1。

2.2 肿瘤浸润CD4+、CD8+T淋巴细胞水平与结直肠癌患者临床病理特征的关系 结直肠癌组织中CD4+、CD8+T淋巴细胞水平与肿瘤分期、浸润深度密切相关（P＜0.05）；而与年龄、性别、肿瘤位置及大小等无关（P＞0.05）。同时，淋巴结转移与肿瘤浸润CD8+T淋巴细胞密切相关（P＜0.05），而与肿瘤浸润CD4+T淋巴细胞无关（P＞0.05）。见表1。

2.3 肿瘤浸润CD4+、CD8+T淋巴细胞水平与结直肠癌患者的生存预后分析 109例结直肠癌患者随访，其中失访10 例（其中包括非肿瘤相关死亡病例）。生存曲线分析显示，高水平CD8+及CD8+/CD4+结直肠癌患者的DFS和OS较好（P＜0.05）。而CD4+T细胞浸润结直肠癌患者的DFS、OS与低水平组差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。

图1 免疫组织化学检测肿瘤浸润CD4+、CD8+ T淋巴细胞水平（×200）

表1 肿瘤浸润CD4+、CD8+ T淋巴细胞水平与结直肠癌患者临床病理特征的关系

2.4 影响结直肠癌患者预后的Cox单因素及多因素分析 单因素Cox回归分析结果显示，结直肠癌患者预后DFS和OS与肿瘤分期、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、CD4+、CD8+及CD8+/CD4+密切相关（P＜0.05），而与年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤大小无关（P＞0.05）。将上述预后相关因素进行多因素Cox回归分析，显示肿瘤分期、淋巴结转移、CD8+及CD8+/CD4+均为结直肠癌患者术后DFS和OS预后不良的独立危险因素（P＜0.05），同时浸润深度仅为DFS预后的独立危险因素（P＜0.05），见表2。

3 讨论

图2 肿瘤浸润CD4+、CD8+ T淋巴细胞水平与结直肠癌患者预后的生存曲线

表2 影响结直肠癌患者预后的Cox单因素及多因素分析

结直肠癌的发生、发展是一个多因素、多阶段与多基因变异积累的、复杂的病理演变过程，涉及到肿瘤细胞与正常细胞的增殖和凋亡、机体对肿瘤细胞的免疫监视、肿瘤细胞的免疫逃逸等多个环节[7]。研究证实，T淋巴细胞介导的抗肿瘤免疫反应在机体有效清除肿瘤原发病灶、防止肿瘤转移中起着重要作用。其中，肿瘤特异性CD4+和CD8+T淋巴细胞效应功能受损或呈耗竭时表现为促炎细胞因子的生成减少，对抗原的刺激反应性低[8]。因此，CD4+及CD8+可能成为恶性肿瘤的新生物标志物和判断治疗及预后的细胞靶点。

本研究通过对结直肠癌组织标本进行免疫组织化学分析，发现结直肠癌组织中CD4+及CD8+T淋巴细胞浸润水平明显高于癌旁组织。现在认为，肿瘤浸润淋巴细胞在恶性肿瘤组织中的浸润程度，以及淋巴细胞亚群的比例变化，影响预后生存[9]。已有研究表明，淋巴细胞的浸润程度可能与结直肠癌形成等有一定的相关性[10]，与我们的研究结果一致。同时，进一步分析CD4+及CD8+肿瘤浸润T淋巴细胞与临床病理特征及预后的关系，提示CD4+及CD8+T淋巴细胞水平与肿瘤分期、浸润深度密切相关（P＜0.05）。运用Kaplan-Meier及Log-Rank检验分析，高水平CD4+、CD8+及其CD4+/CD8+结直肠癌患者预后较好，与以往研究[11]相一致。进一步推测CD4+及CD8+肿瘤浸润淋巴细胞变化可能改变肿瘤微环境免疫平衡，参与肿瘤的发生、发展，影响肿瘤预后。本研究还通过Cox回归单因素及多因素分析亦发现，肿瘤分期、淋巴结转移、CD8+及CD4+/CD8+均为结直肠癌患者术后DFS和OS预后不良的独立危险因素（P＜0.05）。因此，肿瘤浸润淋巴细胞可作为评价术后患者复发风险和总生存率的预测指标。

目前认为，T淋巴细胞是强有力的、对肿瘤细胞有直接杀伤作用的细胞，可抵抗肿瘤发生、转移，承担着肿瘤的免疫监视作用[12]。T淋巴细胞主要分为CD4+T亚群及CD8+T淋巴细胞亚群，其比例和功能等特征在一定程度上反映了机体抗肿瘤反应的总体水平。CD4+T细胞亚群主要包括Th1细胞亚群、Th2细胞亚群、Th17细胞亚群、调节性T细胞（Treg）等，各特异性亚群的功能不同，部分在宿主防御反应和免疫介导的疾病中起着决定性的作用[13]。研究发现Thl细胞亚群和几乎所有类型的癌症改善的临床结果有强烈的关系[14]。另外，以表达CD4+/CD25+/FoxP3+为特征的Treg细胞能够抑制T细胞的免疫功能并能干扰免疫疗法的作用[15]。CD8+T细胞被认为是肿瘤微环境中浸润的主要淋巴细胞亚群，表现为细胞毒性效应。一方面，它能够通过分泌细胞毒性颗粒如穿孔素、颗粒酶和细胞表面受体如TNF相关的凋亡诱导配体（TRAIL）来杀伤肿瘤细胞，承担免疫防御和免疫监视的功能[16]。另一方面，识别肿瘤细胞上的特异性抗原，且在Th细胞的帮助下活化，进一步杀伤肿瘤细胞[17]。因此，本研究中CD4+及CD8+T淋巴细胞浸润可在一定程度上反映抗肿瘤免疫功能，可作为预测远期生存的标志。

关于CD4+T淋巴细胞水平是否有利于癌症患者预后的评估仍存在相当大的争议。研究表明高CD4+T淋巴细胞浸润的膀胱癌患者，其预后较差[18]。而另一研究表明，CD4+T淋巴细胞浸润的程度和患者的预后呈明显正相关[19]。本研究创新性采用CD4+联合CD8+T淋巴细胞浸润综合比较分析预测结直肠癌患者预后，并作为评价DFS及OS独立因素之一。目前，广泛被接受的假说是癌症患者的预后取决于浸润的CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的比值。CD4+/CD8+T淋巴细胞保持动态平衡，以维持机体细胞免疫功能的稳定。改变了组织局部免疫微环境，免疫抑制加重，免疫监视功能减弱，有利于肿瘤细胞增殖，从而有利于肿瘤的进展、侵袭或转移[20]。本研究结论表明，CD4+、CD8+表达下降提示结直肠癌患者预后更差，在一定程度上与上述结论相符合。

综上所述，CD4+及CD8+T淋巴细胞浸润水平对结直肠癌患者预后的评估有重要指导价值，但其机制等仍有待进一步研究。此外，此研究对于寻找结直肠癌治疗的免疫疗法有很大的提示意义。