PD-L1在结直肠癌组织中的表达及临床意义

杜舟，黄萍，黄国裕，韩少良，左志贵

（1.温州医科大学附属第一医院 疝与腹壁外科，浙江 温州 325015；2.温州医科大学 发展规划处，浙江温州 325035；3.温州医科大学附属第一医院 胃肠外科，浙江 温州 325015；4.温州医科大学附属第一医院 结直肠肛门外科，浙江 温州 325015）

结直肠癌是全球最常见的消化道恶性肿瘤之一，每年有近102万的新发病例以及约53万的死亡病例，位居世界恶性肿瘤发病率和病死率第3位[1]。我国的结直肠癌多见于中年人，因其在临床上常缺乏较为典型的症状和体征，发现及确诊时多已进入癌症中晚期，导致了我国结直肠癌第5位的高病死率，并呈现持续上升的趋势[2-3]。免疫逃逸是肿瘤发生发展的重要机制之一，它是一个需要协同刺激分子参与的肿瘤抗原性特异性T细胞诱导凋亡和无反应性的过程[4]。程序性死亡配体-1（programmeddeathligand 1，PD-L1）是重要的协同刺激分子B7家族的成员之一，因此也称B7-H1。研究发现，PDL1在肺癌、肝癌、乳腺癌、鳞状细胞癌及卵巢癌等多种癌组织内[5]以及多种肿瘤细胞内均存在高度表达[6]，升高的PD-L1与程序性死亡受体-1（programmed death I，PD-1）相结合，从而减弱组织的抗肿瘤免疫反应。然而，其在结直肠癌中的表达情况鲜有报道。本研究通过检测PD-L1在结直肠癌组织、相应癌旁正常组织中的表达情况，观察PD-L1的表达与结直肠癌患者临床病理特征之间的相关性，探讨其潜在的临床意义。

1 资料和方法

1.1 一般资料 随机选取2016年1月至2017年1月温州医科大学附属第一医院50 例结直肠癌手术患者，所有纳入实验的患者均经病理学确诊为结直肠癌，且直至术前均未接受放/化疗，各项临床检测指标完整无缺失。纳入实验的50例结直肠癌患者在术中获取肿瘤组织用以后续实验，并获取在距离肿瘤组织5 cm以上的癌旁组织作为对照。纳入实验的患者，男33例，女17例，年龄（63±12）岁。入组的患者均在住院期间完成常规术前检查，记录肿瘤标志物癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）和糖类抗原199（carbohydrate antigen 199，CA199）水平，术中对癌组织进行病理切片明确癌组织分化程度，淋巴结转移情况，并且追踪并记录是否进行化疗。本研究经本院伦理委员会批准，所有入组患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR:使用TRIzol试剂（美国Promega公司）从组织中提取总RNA并进行定量。将1 μg RNA进行反转录（反转录试剂盒购自美国Promega公司）以合成cDNA。随后，在基因特异性引物的存在下，用SYBR Premix ExTq（日本Takara公司）对cDNA和ROX II的混合物进行实时定量PCR。下一步，在CFX96实时PCR检测系统（美国Bio-RAD公司）中根据PCR标准化方案定量转录PD-L1。采用管家基因β-actin作为内部对照。引物序列见表1[7]。

表1 PCR引物序列

1.2.2 Western blot:将组织进行匀浆并使用裂解缓冲液[50 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，0.5%Nonidet-40，5 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF（pH 8.0）]进行裂解，然后在13 000×g、4 ℃下离心30 min。通过BCA蛋白质测定试剂盒（上海碧云天公司）确定上清液中的蛋白质浓度。随后，通过在4×nuPAGE上样缓冲液（美国Life Technologies公司）中加入20 μg在100 ℃下加热5 min后变性的等量蛋白质，通过10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶（美国Life Technologies公司）电泳进行跑胶，并将蛋白转膜至PVDF膜（美国Millipore公司）上。用含有0.05% Tween-20的Tris缓冲液（TBST）配制5%脱脂牛奶进行封闭，随后用抗体（英国Abcam公司）PD-L1（1:10 000）、β-actin（1:5 000）在4 ℃下孵育过夜。第2天使用二抗孵育，并使用Image Lab软件（美国Bio-Rad公司）进行扫描和半定量分析。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS22.0统计学软件进行数据分析。计量资料用表示，2组间比较采用两独立样本t 检验，计数资料分析采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PD-L1在结直肠癌组织、癌旁正常组织中的表达 在50例结直肠患者中，PD-L1 mRNA水平在癌组织中显著高于癌旁正常组织（1.00±0.20 vs.1.86±0.61，P＜0.05）。与癌旁组织相比，结直肠癌组织中PD-L1 蛋白表达量也显著升高（0.32±0.22 vs.1.21±0.68，P＜0.05）。选取5例患者的Western blot条带图，较为典型地展示同一患者癌组织与癌旁组织PD-L1蛋白水平的差异，见图1。

2.2 结直肠癌组织中PD-L1的表达与临床病理特征的关系 在结果2.1中，将Western blot条带灰度值为0判断为PD-L1蛋白阴性（-）表达，将其余判定为PD-L1蛋白阳性（+）表达。通过统计分析，PD-L1的表达在性别、年龄、部位以及组织学分类及术前CEA、CA199水平中差异无统计学意义（P＞0.05）；PD-L1在中低分化的癌组织中表达阳性率高于高分化癌组织（P=0.050）；PD-L1的表达与淋巴结转移与否有关，发生淋巴转移的癌组织PD-L1阳性表达率明显高于无淋巴转移者（P＜0.05），见表2。

3 讨论

图1 结直肠癌患者PD-L1蛋白条带图

表2 结直肠癌患者基本特征与临床病理特征（例）

随着我国人民生活水平不断提高，国民饮食结构发生了较大的变化，结直肠癌发生率逐年升高[8]。临床上普遍运用肿瘤标志物CEA和CA199联合检测来诊断结直肠癌并进行预后判断[9]。CEA的升高对诊断结直肠癌有着很大的参考价值，但缺乏较高的敏感度[10]，常导致诊断及治疗最佳时期的错失。近些年随着对肿瘤免疫学研究的不断发展，免疫逃逸机制的作用越来越为众多研究者所重视。其中，CTL介导的T细胞免疫是人体抗肿瘤的主要细胞免疫之一。而协同刺激分子的缺失，将导致第二信号的缺如，从而导致肿瘤细胞逃避机体的免疫系统，不断地增殖和扩散[11]。人体的程序性死亡分子PDL1基因位于染色体9q24，可通过与CD28超家族中的受体PD-1相结合，调节机体的免疫反应。

本研究通过基因水平及蛋白表达水平对50例结直肠癌患者进行观察，结果显示:在基因水平，结直肠癌组织中的PD-L1水平显著高于癌旁组织，这一结果与SASIDHARAN等[7]的研究结果相一致。在蛋白质水平，PD-L1蛋白在结直肠癌组织中的阳性表达率比癌旁正常组织高，且PD-L1在中低分化癌组织中的阳性率明显高于高分化癌组织，相似的实验结果在胃癌组织的PD-L1检测中也有报道[12]。HUA等[13]研究表明33例结直肠癌患者中PD-L1的表达明显高于正常组织。已有研究报道PD-L1在多种实体肿瘤组织中呈现表达上调，如乳腺癌[14]、肾癌[15]、肺癌[16]等。但国内外有关PD-L1的高表达现象与癌症患者临床病理特征的相关性尚未达成共识[17]。PD-L1/PD-1信号通路通过诱导T细胞凋亡或无能、促进免疫抑制因子的产生等机制削弱机体抗肿瘤免疫应答，促进肿瘤的免疫逃逸，与肿瘤的高侵袭性及不良预后相关[18]。本研究显示PD-L1在肿瘤组织中的表达还与淋巴结转移有关，有淋巴结转移的患者PD-L1阳性率显著高于无淋巴结转移患者，我们推测PD-L1表达越强的患者，肿瘤转移可能性越大，其预后越差。这也进一步表明PD-L1可能参与肿瘤免疫逃逸机制。LIN等[19]研究表明肺癌组织PD1、PD-L1阳性表达与肿瘤直径、淋巴结转移及组织学分级有关。TOPALIAN等[20]研究发现肿瘤细胞表达的PD-L1过程中下调了肿瘤细胞和基质细胞微环境中浸润型T细胞的数量，认为肿瘤细胞表达PD-L1在抵抗肿瘤的免疫反应过程中发挥着重要的作用。张占芳等[21]通过流式细胞学技术检测75 例患者骨髓原始细胞中PD-L1的表达情况发现，PD-L1在白血病细胞中表达的总体阳性率为32%，表明PD-L1可能参与白血病细胞的免疫逃逸及原发耐药机制，WANG等[22]通过对胰腺癌病例建立COX比例风险回归模型分析发现PD-L1可作为胰腺癌患者预后评价的独立指标。

综上所述，本研究中结直肠癌组织中的PD-L1表达明显高于癌旁组织，并且与肿瘤的分化程度及淋巴结转移相关，表明其可能作为判断结直肠癌患者病情进展及预后的依据之一，同时，也提示PD-L1在肿瘤的免疫逃逸中发挥一定作用。有文献报道PD-1/PD-L1信号通路通过ITSM磷酸化从而调节细胞代谢、蛋白合成、增殖与凋亡的经典通路PI3K-AKTmTOR来参与免疫应答[23]。本课题组将会在后续的实验中验证PTEN-PI3K-Akt通路对PD-L1表达调控的具体机制。