弓形虫基因型分型研究新进展※

●孙青松 王千寻 宫凤颖 李沐森

（吉林农业科技学院动物科技学院，预防兽医学吉林省重点实验室 吉林 吉林 132109）

1 弓形虫病病原学

弓形虫是一种专性细胞内寄生的人兽共患寄生虫，宿主类型广泛[1]，包括家畜、家禽及野生动物，在犬、猫、鸟、鱼等动物体内均可寄生[2]。据不完全统计，全球约有1/3 人口感染弓形虫，我国弓形虫感染率达8%。中间宿主的感染主要通过3种途径：一是食用被猫粪便中寄生虫卵囊污染的食物或饮水，二是食用含弓形虫包囊的生肉或半生的肉类，三是经胎盘传播给下一代[3]。孕妇感染弓形虫可致流产、早产、死胎、畸胎甚至胎儿死亡。免疫功能低下或免疫缺陷者感染弓形虫是导致死亡的一个主要原因[3]。

弓形虫的虫种只有1种，但不同宿主感染后，其致病性和敏感性却有着很大差异。弓形虫生长过程主要包括5种形态，在中间宿主体中有2种存在方式，分别是滋养体和包囊；在终末宿主体中则有3种存在方式，分别是裂殖体、配子体和卵囊。

弓形虫具有80 Mb的基因组，其染色体数目为11 条。基因组的相似度较高，但其位点的多个基因存在多态性，所以在表型上弓形虫存在显著差异。SAG1 具有1634bp的基因全长，有单个开放阅读框存在其中，不具有内含子且为单拷贝，虫体侵入宿主细胞后，P30 蛋白在编码后严重影响毒力情况，免疫保护性和原性较高，是主要的表面抗原，一般用于疫苗开发和诊断技术的研发。SAG1的开放阅读框具有前号肽、功能区和疏水区，编码氨基酸数为336个，大小约为30KD，在原核表达过程中蛋白主要存在于包涵体中，没有生物活性[4]。

SAG2 基因在速殖子中编码P22 蛋白，是主要的弓形虫表面抗原，考虑到该基因具有一定的差异性，将其分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型3个基因型，并且在DNA序列上的相差水平仅为l%～2%，但在对鼠类的致病性上却有较大差异[5]。SAG3 基因编码一种表面抗原蛋白，表达于缓殖子、速殖子和孢子期，分子量大小为43 KD，其三级结构与P30 蛋白相似，可能在弓形虫黏附和侵入宿主细胞中发挥较为重要的作用[6]，然而在SAG3 基因其他功能领域中的研究还不够全面，还需要我们进行深入了解分析。弓形虫的另一个必需功能蛋白是棒状体蛋白，其来源于杆状体。由于宿主个体被寄生虫寄生，所以ROPl的免疫原性也相对较高。ROP2 在虫体侵入宿主细胞的过程同样也起着重要作用。ROP2 还具备诱导体液免疫产生Ig A、Ig M、Ig G的能力，以及影响机体产生IFN-。

2 弓形虫基因型分型研究进展

2.1 弓形虫基因分型的研究方法

人类对弓形虫基因分型的研究始于1992年，Sibley根据来自五大洲的28株弓形虫分离株在小鼠身上的毒力实验，将对小鼠致病力不同的弓形虫分为强毒株和弱毒株。之后，1995年由Daniel Howe和David Sibley对来自北美洲和欧洲的不同人和动物体内的106 份弓形虫分离株的基因型进行分型，并首次提出了将弓形虫株分为I型、II型和III型的经典基因型分类法，这在弓形虫株的基因型分型领域一度成为研究者的参考标准，标准基因型虫株也由此确立。

2005 年之前，大多采用单个基因位点进行基因型分型研究，单位点扩增在基因分型中存在较大的误差，使许多新的非典型基因型不能与标准型区分开来，之后随着对不同地理区域的野生动物和人类患者体内的弓形虫分离株的基因分型研究，越来越多的重组型和非标准型基因型被发现，并且这些非典型的基因型表现出高频率，这表明弓形虫种群的总体多样性可能会远远高于我们的预期。

在Howe等人的研究中，大多数的基因分型研究只是依靠几个双等位基因标签，在临床样品中弓形虫的DNA含量较低时，其分辨率和辨别力也相当低，同时由于选取的位点不同，不同实验室的结果得出的结论也是不同的[7]。

对弓形虫基因型分型研究的方法主要包括PCR-RFLP、多位点测序分型法（MLST）、微卫星分型法、随机扩增多态性DNA（RAPD）、血清型分析法、内含子测序分析法等。多位点测序分型法是对扩增的特定DNA序列进行测序来测定单核苷酸多态性（SNPs）的方法，此种方法是建立在DNA序列的核酸多态性基础之上的；微卫星分型法是根据弓形虫中微卫星重复次数的差异所导致的DNA序列长度的多态性建立起来的；随机扩增多态性DNA是在PCR基础上对整个未知基因组进行多态性分析的技术；血清分型法是人工合成构成弓形虫抗原的一些肽类，由于这些肽类含有弓形虫的多态性位点所编码，所以仅需宿主的血清就可对弓形虫进行分型；内含子测序分析法是对内含子进行PCR扩增后，对其进行测序检测内含子序列中的单核酸多态性。在2006年，Su等发表了通过多位点的PCR-RFLP分子标记对弓形虫进行基因型分型的方法[8]，这种方法简便且分辨率高，逐渐成为弓形虫基因型分型的主要方法。

2.2 弓形虫基因型分型现状

弓形虫的基因型分型揭示了基因的多样性，同时显示弓形虫有3个主要的无性系（I型、II型和III型），现在被分为6个主要演化支下的15个单倍群[9]。在法国，有关人类弓形虫病的研究显示，I型和II型虫株具有突出的感染优势[10]。最近，对南美洲地区的人体和动物体中的弓形虫研究表明了南美洲地区弓形虫丰富的遗传多态性[11-13]。在南美洲，免疫功能正常的弓形虫病人常常显示与非典型虫株（非I型、II型或III型）的感染有关[14]。其他研究表明在中国的优势弓形虫基因型为ToxoDB#9（也被称为Chinese 1）[15]。而在非洲高度流行II型、III型、Africa1 和Africa3的基因型[16]。

近年来，有关猪的弓形虫基因型分型表明葡萄牙、法国、日本和美国北部猪感染的弓形虫基因型为在世界广泛流行的I型、II型和III型，巴西东北部猪群之间流行的为6个弓形虫的非典型性基因型[17]。

3 我国弓形虫基因型分型研究进展

我国弓形虫的基因型分型研究起步较晚。对于动物感染弓形虫株的基因型分型研究始于2007年，流行于中国猪群之间的弓形虫的优势基因型为ToxoDB #9型，少数为ToxoDB #204型、ToxoDB #205型或ToxoDB #213型[18-20]。Dubey等在2007年首先采集了34只流浪猫的血清和粪便，采用凝集法检测血清弓形虫抗体，结果表明流浪猫的血清抗体阳性率高达79.4%；然后采集猫粪便的弓形虫卵囊，并对17个分离虫株10个位点进行PCR-RFLP基因型分型，试验结果发现了2个基因型，其中ToxoDB#9型占多数[1]。

另外在野生动物如麻雀、高原鼠兔和野鼠、家禽、流浪猫、家兔、家猪、市售猪肉、宠物犬以及人体内均分离到了弓形虫的虫体[21]。近些年来国内研究从219种动物及人体内分离得到弓形虫虫株或者基因组，结果显示共分离到12个基因型[1]。其中Chinese 1 基因型虫株占所有分离株的66.36%，因此Chinese 1 为我国优势基因型，其次为Ⅰ型和Ⅱ型（变异型），这与非洲、北美洲和欧洲的原型克隆谱系差异很大[1]。

由此可见，通过对我国存在的弓形虫调查发现，中国弓形虫分离株具有有限的遗传多态性，且Chinese1型为其优势基因型[1]。猪是人类感染弓形虫病的重要来源，猪肉是中国居民最主要的肉食来源，因此猪源弓形虫感染的研究显得至关重要[1]。目前中国关于猪源弓形虫的流行病学及基因型分型研究主要来自广东、云南、安徽、贵州、江西、四川、重庆，东北地区仅有辽宁省的一次报道。另外弓形虫对我国野生动物尤其是一些特种名贵的野生经济动物的感染，对其进行调查和研究是十分重要和必要的。

4 展望

全球广泛分布的弓形虫基因型主要为I型、II型和III型，在小鼠体内的毒力实验表明I型为强毒株，II型为中等毒力株，III型为弱毒株，但因为基因型与相关蛋白的多态性密切相关，如致密颗粒和棒状体，所以弓形虫在小鼠和人体内的致病性是不同的[22]。此外，每个地区感染弓形虫的基因型和风险因素不同，人化区域与野生区域弓形虫发生基因互换的几率也不同，导致不同基因型的致病力、药物敏感性、感染力等有所差异[23]。

早期的研究表明，来源于欧洲和北美洲的刚地弓形虫分离虫株主要分成3个单克隆谱系，即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，且最近的研究表明分布在欧洲、北美洲、非洲和亚洲地区的弓形虫具有有限的基因多样性，而分布于中美和南美地区的弓形虫则具有丰富的多样性基因型。对我国东南部、中部和西部地区调查发现，中国弓形虫分离株具有有限的遗传多态性，且Chinese1型为其优势基因型[24]。

弓形虫的基因分型和遗传多态性的发现是近些年弓形虫研究的重要进展，具有重要的生物学意义和临床意义。如通过对某地区弓形虫病的流行分布及基因型进行鉴定，对该地区弓形虫遗传多样性进行分析，不仅能为弓形虫的遗传多态性数据库做补充，也为弓形虫病针对性防控及公共卫生问题的应对提供理论参考。通过基因型可以掌握本地区流行于动物群之间的弓形虫毒力和传播途径，并采取相应的预防及治疗措施，也可以为将来弓形虫疫苗的研制提供基础性支持。