超高效液相色谱-高分辨质谱检测白酒中8种人工甜味剂

2020-12-24尹艳艳熊晓通田栋伟陈明学程平言

酿酒科技 2020年12期

尹艳艳，熊晓通，田栋伟，刘明，陈明学，张健，程平言

（贵州茅台酒厂（集团）习酒有限责任公司,贵州遵义 564622）

民以食为天，食以安为先。食品的安全和健康已成为消费者关心的重点。食品中各种添加剂的使用情况越来越受到人们的关注，其中，甜味剂是食品行业中常用的添加剂。在白酒中添加甜味剂可掩盖酒体苦涩等不良口感的缺陷，增加醇厚感和绵甜感[1]。然而，研究表明摄入高剂量的甜味剂会对人体的肝脏和神经系统造成伤害，甚至引发癌症[2-3]。GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中规定，固态发酵白酒中不得添加甜味剂[4]。因此，开发一种快速、灵敏、准确的甜味剂检测方法对于提高产品的质量和保障消费者的饮酒安全具有重要意义。

目前已建立了食品中甜味剂的国家标准检测方法[5-11]，但该方法无法实现多种甜味剂同时检测，且预处理过程较为繁琐。高效液相色谱法[12-14]、离子色谱法[15]、毛细管电色谱[16]等现代分析检测技术已被用于白酒甜味剂的分析检测。但这些方法因检出限不能满足检测要求、易出现假阳性等问题而不能满足白酒中甜味剂的同时检测要求。液相色谱-质谱联用技术由于具有分离速度快、检测灵敏度高、用样量少、自动化程度高等优点，且可以弥补其他分析方法不能实现同时检测的不足，被广泛应用于白酒分析检测领域[17-19]。此外，超高效液相色谱-高分辨质谱对目标化合物和非目标化合物具有良好的定性/定量分析筛选能力，对假阳性结果可进行进一步确证，通过单针进样分析可实现对复杂基质中成百上千种痕量组分进行鉴定、定性和定量，大大简化了复杂样品的残留分析，提高检测效率[20-21]。本研究建立了一种同时检测白酒中8种人工甜味剂的超高效液相色谱-高分辨质谱检测方法，可应用于白酒中多种甜味剂含量的监控，为白酒安全监管和质量评定提供简便快速、科学准确的检验方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Q ExactiveFocus 高分辨质谱仪（美国Themo-Fisher Scientific 公司）；UltiMate 3000 高效液相色谱仪（美国Dionex 公司）；分析天平（0.0001 g，美国OHAUS 公司）；BPG 型精密鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；涡旋振荡器（上海琪特分析仪器有限公司）；艾科普超纯水机（美国Millipore公司）；Hypersil GOLD 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm；美国ThemoFisher Scientific公司)。

甜蜜素、糖精钠、安赛蜜、甜菊糖苷、三氯蔗糖、阿斯巴甜、纽甜以及阿力甜标准品（纯度均＞99%）购于德国Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；乙腈、甲醇、甲酸、乙酸胺（色谱纯）购于美国Fisher公司；实验用水为艾科普纯水仪制备的超纯水（18.2 MΩ·cm-2），白酒样品为贵州茅台酒厂（集团）习酒有限责任公司成品酒以及市购白酒。

1.2 标准溶液的配制

准确称取（精确至0.0001 g）适量甜蜜素、糖精钠、安赛蜜、甜菊糖苷、三氯蔗糖、阿斯巴甜、纽甜以及阿力甜标准品于100 mL棕色容量瓶中，少量超纯水溶解，乙腈定容，再用超纯水配制成质量浓度为10.0 μg/L、30.0 μg/L、50.0 μg/L、100.0 μg/L、200.0 μg/L、300.0 μg/L 的混合标准溶液，于4 ℃贮存备用。

1.3 样品前处理

本方法采用烘箱干燥法除去白酒中高含量的乙醇，减少对待测物检测的影响[19]。具体操作：取1 mL 酒样于1.5 mL 的离心管，置于干燥箱（80 ℃）中去除乙醇，保留0.5 mL余量，超纯水定容至1 mL，0.22 μm水相滤膜过滤，待测。

1.4 实验条件

1.4.1 液相色谱条件

色谱柱：Hypersil GOLD 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；柱温：35 ℃；进样体积：10 μL；流动相：A 相为5 mmol/L 乙酸铵水溶液，B 相为乙腈；流速：0.3 mL/min；梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.4.2 质谱条件

离子化模式：电喷雾电离（HESI）负离子模式；喷雾电压：2.5 kV；鞘气：35 psi；辅助气：10 arb；离子源加热温度：350 ℃；离子传输管温度：320 ℃；扫描模式：Full Mass，扫描范围：100 m/z～1000 m/z。

2 结果与讨论

2.1 实验条件考察

2.1.1 液相色谱的条件优化

以乙腈-乙酸铵的水溶液作为流动相，考察了SyncronisHilic（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）液相色谱柱、Accucore aQ（150 mm×2.1 mm，2.6 μm）液相色谱柱以及Hypersil GOLD（100 mm×2.1 mm,1.9 μm）对8种人工甜味剂分离效果的影响。实验结果（图1、图2）显示，8 种人工甜味剂在Syncronis Hilic 色谱柱保留较差，故易受基质干扰，峰形较差；安赛蜜在Accucore aQ 色谱柱出现前出小峰，且甜蜜素、糖精钠在Accucore aQ 色谱柱保留时间较短。进一步通过优化进样量（5 μL、10 μL、15 μL）、流动相乙酸铵的浓度（0 mmol/L、2.5 mmol/L、5.0 mmol/L、7.5 mmol/L、10.0 mmol/L、）以及柱温（25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）也未能解决Syncronis Hilic 色谱柱和Accucore aQ 色谱柱保留时间短和峰型差的问题。根据图3，8 种人工甜味剂在Hypersil GOLD 色谱柱分离效果较好，峰型对称。

2.1.2 质谱条件的优化

Full Mass 扫描模式以母离子精确质量数和保留时间对目标物进行定性和定量，易造成假阳性检测结果。Full MS/dd-MS2 扫描模式以母离子和碎片离子精确质量数定性，母离子定量，可同时实现对目标物定性筛查及定量检测[22-23]。因此，本研究采用Full MS/dd-MS2扫描模式对母离子进行定性，并优化了不同目标物的碰撞电压，进一步用目标物的碎片离子进行确认，排除假阳性的结果，设置条件见表2。最终选择Full MS 扫描模式以母离子精确质量数对目标物进行定量检测。

2.2 方法学考察

2.2.1 方法的线性范围、检出限和定量限

以目标物定量离子峰面积为纵坐标，标准溶液质量浓度为横坐标，绘制各目标物的标准工作曲线。结果表明，8 种人工甜味剂线性良好。以定量离子信噪比S/N=3 对应的浓度为样品的检出限（LOD），S/N=10 为样品的定量限（LOQ），具体结果见表3。

2.2.2 方法的准确度和精密度

图1 采用SyncronisHilic色谱柱8种人工甜味剂提取离子色谱图

图2 采用Accucore aQ色谱柱8种人工甜味剂提取离子色谱图

图3 采用Hypersil GOLD色谱柱8种人工甜味剂提取离子色谱图

通过实际样品加标回收率考察了该方法的准确度。白酒样品中加入适量甜味剂混合标准溶液，配成加标浓度分别为50 μg/L 和100 μg/L 的加标样品进行分析。加标样品设置5 个平行样，连续测定5 d，每天测定5次，并计算其平均加标回收率以及日内和日间相对标准偏差（RSD），考察该方法的准确度与精密度。表4结果显示，8种人工甜味剂在白酒样品中的加标回收率在89.8%～108.3%之间，RSD均小于4.5%。该方法的准确度与精密度均满足白酒样品中甜味剂的分析要求。

2.2.3 实际样品分析