东方伊萨酵母固态菌剂的制备及其在白云边酒酿造过程中的应用效果分析

熊小毛，彭 俊，缪礼鸿，赵永威，刘蒲临

（1.湖北白云边酒业股份有限公司,湖北松滋 434200；2.武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉 430023）

自然发酵是一项历史悠久的利用微生物生产食品的技术。通过自然发酵获得的产品通常表现出独特的风味、质地或营养特性等特征[1]。许多知名品牌的中国白酒均采用传统自然发酵工艺，没有特意添加已知的微生物到发酵过程中去[2]。白云边浓酱兼香型白酒是我国的主要白酒类型之一，它的发酵生产可分为3 个重要阶段，包括制曲、堆积发酵和入池发酵[3]。制曲过程中的微生物构成是造就不同白酒风格的关键成因之一[4]。大曲制作是在开放的环境下，在制曲过程中会接种少量母曲，而其他微生物则与原产地的环境密切相关[5]。随着研究技术水平的提高，人们当前更为深入的认识了大曲和发酵过程中微生物种群结构和多样性变化，并进一步探索了微生物之间的相互作用及风味物质产生机理[6]。在此基础上，分离和筛选原产地的功能菌种以强化酒曲性能逐渐引起重视。王耀等[7]试验将筛选的有益功能菌先制成种曲，然后以1%接种量接种到生料中制作强化曲，在该工艺下所生产出强化曲的各项指标均优于或达到传统大曲标准。唐玉明等[8]在不同酒曲样品中筛选出1 株发酵功能菌和1株产香功能菌以及2株糖化菌，将其复合，添加到制曲中，强化曲的微生物数量和酶活力显著增加，酯化力增加55.49%，应用到生产中出酒率提高10.89%，总酸、总酯分别提高23.8%和5.9%。

东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）是一种对白云边酒发酵有较大贡献的酵母，其在酒醅中数量较多，同时也可以在原产地周边的土壤等环境中筛选获得[9]。前期研究表明，白云边酒醅来源的东方伊萨酵母除具有较强的产乙醇能力外，还具有耐热、耐酸性好，产酸、产酯能力强等的特点，对浓酱兼香型白酒酒体的形成具有重要作用[10-11]。在此基础上，我们以从白云边酒醅中选育的1 株出酒率高、正丙醇含量较低的I.orientalisP43 功能菌种为基础，制作固态功能菌剂，追踪检测不同固态菌剂储藏方法对I.orientalisP43 存活率的影响；并使用该固态菌剂制作强化曲应用于白云边原酒的实验性生产。结果表明使用强化曲所生产原酒正丙醇含量显著降低，出酒率也有明显提升。本研究为复合功能强化曲的制备方法和应用提供了参考依据，为改善浓酱兼香型白酒的发酵技术和提高原酒的品质奠定了技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

I.orientalisP43 从白云边酒醅中分离，真空冷冻干燥保藏[9]。

1.1.2 培养基

YPD 培养基[12]：葡萄糖20 g、酵母膏10 g、蛋白胨20 g、蒸馏水1000 mL；115 ℃，25 min灭菌。

马丁孟加拉红培养基[12]：葡萄糖10 g、蛋白胨5 g、KH2PO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、孟加拉红33.4 mg、链霉素溶液30 μg/mL、蒸馏水1000 mL，121 ℃，20 min灭菌。

牛肉膏培养基[12]：NaCl 5 g、牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、蒸馏水1000 mL；调节培养基pH7.2～7.4，121 ℃，25 min灭菌（固体培养基添加2%琼脂粉）。

1.1.3 固态菌剂制备原料

小麦：由湖北白云边酒业股份有限公司提供。小麦中酵母活菌数少于10 cfu/g，细菌活菌数少于105cfu/g。

玉米淀粉：市购的食品级面粉，真菌活菌数少于10 cfu/g，细菌活菌数少于103cfu/g。

1.2 实验方法

1.2.1 淀粉吸附东方伊萨酵母菌剂制备及菌体死亡率测定

挑取东方伊萨酵母单菌落接种于YPD 液体培养基，30 ℃，170 r/min，摇床培养24 h。按2%接种量再次转接到500 mL 的液体YPD 培养基中，30 ℃，170 r/min 培养12 h，使用血球计数板对酵母菌数量进行测定。取扩培12 h 后的菌液100 mL，分别与200 g、250 g、300 g、350 g 面粉，混合均匀。真空包装后将不同比例混合的菌剂分成两份，一份放置在4 ℃冰箱存放，一份放置在25 ℃培养箱中存放。每隔1周，取样测定活菌数。

1.2.2 功能强化曲块的制备

小麦经适当粉碎后，取上述制备好的菌剂按1×107cfu/g(干基)接种，菌粉加水混匀（水分控制在42%）后倒入粉碎的小麦中，搅拌均匀后，采用4 种不同的制曲方式制备实验曲块（表1），将做好的曲块放置在大塑料盒中室内常温发酵（塑料盒表面用双层纱布覆盖，保持一定通风）。

表1 强化曲的制备方案

表2 不同比例淀粉吸附后菌剂的含水量与酵母死亡率

1.2.3 生产实验

白云边酒业股份有限公司每年9 月开始第一轮次生产。高粱经焖粮、蒸粮、摊晾后加入曲粉，将加曲后的醅料堆积发酵，顶温达到工艺要求后，将堆积料转移进窖池，封窖后发酵一个月。10月开始第二轮次操作，将已经发酵一个月的窖池打开，取出酒醅并配上新鲜高粱和清蒸后的稻壳混蒸，混蒸结束后，重复上一轮的操作流程。此二轮操作馏出液酒精含量很低且量少，直接将馏出液回泼到入池酒醅中。11月开始第三轮次操作，将已经发酵一个月的窖池打开，取出酒醅配入清蒸稻壳进行蒸馏取酒，即为三轮一次酒[12]。此次生产实验针对三轮一次原酒正丙醇含量偏高的现象，使用以小麦为原料制备强化曲，替代25%的高温大曲，以改善原酒的品质和乙醇产率。

1.2.4 生产实验中酒醅的理化分析及酵母菌测定

将10 g 酒醅与90 mL 蒸馏水混合，0 ℃超声处理30 min，4 ℃离心10 min 后，用上清液测定还原糖含量和酸度[13-14]。通过计算样品在105 ℃下干燥24 h 后的失水重量来测量酒醅的水分含量。采样点温度在采样时使用温度计测量。使用Wu 等[13]描述的方法分析淀粉含量。酒醅中的乙醇含量蒸馏后使用气相色谱（配备有DB-Wax 柱的Agilent 7820A GC 系统）来进行测定[15]。酒醅中酵母菌的测定使用稀释涂平板法。

2 结果与分析

2.1 淀粉吸附菌剂活菌计数与死亡率测定

菌剂制备所使用种子液的活菌数为1.5×108cfu/mL，菌体被不同比例的淀粉吸附后，酵母的死亡率不同（表2）。菌液和淀粉按1∶2 混合，死亡率最低，为34.0 %；菌液和淀粉按1∶3.5 混合，死亡率最高，为65.8%；菌液和淀粉按1∶2.5 和1:3 混合，死亡率较接近（40.5 %和42.3 %），均高于1∶2 混合的死亡率。

2.2 不同储存条件对吸附菌剂死亡率的影响

4 ℃保存固态菌剂1 周后活菌数死亡率最高，1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5 吸附后的死亡率分别是43.3%、31.3%、22.3%和14.9%；从第1～5 周菌剂的活菌数死亡率在减缓；第5～10 周，菌剂的活菌数死亡率基本稳定，活菌数变化不大，其中按1∶3.5混粉的死亡率变化最小（图1a）。25 ℃保存菌剂同样在第一周活菌数降低显著；1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5吸附后的死亡率分别是54.5 %、51.7 %、48.8 %和32.4 %；从第1～5 周菌剂的活菌数死亡率趋于缓和。其中按1∶3.5 混合吸附的死亡率变化最大，活菌数从114×105cfu/g下降到4×105cfu/g（图1b）。比较两种温度条件可以看出，在整个储存期内（1～10周）25 ℃保存菌剂的死亡率明显高于4 ℃保存的菌剂，且淀粉比例越高活菌数越少。

2.3 功能强化曲块的活菌计数

使用表1 中4 种方案所制成曲块的微生物数量统计如表3 所示。方案一小麦接种后压成曲块，常温发酵6 d 后酵母活菌数为8×108cfu/g，细菌活菌数为3.6×109cfu/g，与方案二对比：散料发酵24 h 后再压成曲块对酵母增殖和抑制细菌生长都没有明显的效果。方案三小麦粉加水加酸调制pH4.0 后接种压成曲块，常温发酵6 d 后酵母活菌数为6×108cfu/g，细菌活菌数为3×108cfu/g，与方案一对比,加酸后的曲块发酵6 d 后细菌数量级由109下降到108。方案四与方案二相比，加酸后发酵的曲块的细菌数降低了1 倍，表明强化曲制备过程中加入有机酸会使酵母菌数量有轻微的减少，但对细菌有明显的抑制效果。所压制曲块于室温下放置30 d 后，4 种方案制作曲块活菌死亡率都极高，且活菌数差异不显著。

表3 不同方案制曲后的微生物计数

图1 固体菌剂4 ℃和25 ℃条件下活菌数随时间变化

2.4 强化曲生产发酵实验中酒醅理化指标分析

以12.8 kg 强化曲添加到白云边二轮入池操作中，替代150 kg 传统大曲参与发酵。实验组和空白组堆积温度变化较为接近，堆积48 h 温度缓慢上升至30 ℃左右，48 h 后迅速升温，96 h 左右基本达到入池要求温度55 ℃左右，温度变化在生产工艺范围内。出入池酒醅的理化指标和酵母菌数量如表4和表5 所示。实验组堆积发酵后分入两个窖池，入池酒醅的水分较对照组要高，酸度、还原糖和酵母数量与对照组无较大差异，均在工艺范围内。

2.5 原酒中乙酸乙酯、乙醇和正丙醇的含量分析

三轮一次原酒的3 个对照组和2 个实验组乙酸乙酯、乙醇和正丙醇的含量分析结果如表6 所示。不同组中，乙醇、乙酸乙酯和正丙醇的含量都有较大的差异，乙酸乙酯含量最高为7457 mg/L，最低为3768 mg/L，相差约2 倍，乙醇含量最高为40 %vol，最低为31%vol，正丙醇最高含量17713 mg/L，最低为14590 mg/L。可见传统白酒三轮一次酒的酒质差异较大，且正丙醇含量较高。两个实验组窖池原酒乙醇的平均含量为43 %vol，正丙醇平均含量为11812 mg/L，乙酸乙酯的平均值为5314 mg/L。正丙醇相对于对照组平均含量降低了27.4%，乙醇含量提高了22.9%。

表5 三轮出池酒醅理化指标与酵母菌计数结果

表6 三轮一次原酒乙酸乙酯、乙醇和正丙醇检测结果

3 讨论

酵母是迄今为止最有效的产乙醇微生物，并且是发酵食品和酒精饮料中最为常用的微生物种类。除Saccharomyces cerevisiae外，虽然大多数酵母乙醇发酵能力和发酵效率较低，但它们产生的挥发性物质对白酒风味的形成产生积极作用[16-17]。I.orientalis是浓酱兼香型白酒中的优势菌株，将其制备成可保存的固态菌剂可以使运输、保存、投放等环节变得更加方便。本研究采用淀粉吸附的方法制备固体菌剂。不同比例淀粉的使用和保存温度不同均显著影响菌体的存活率。当菌液与淀粉不同比例混合吸附时，按1∶2 混合初始死亡率最小，当菌液与淀粉比例进一步变化至1∶3.5 时死亡率达到了65.8 %，可见水分快速丧失会对I.orientalis活力造成较大影响。固态菌剂分别在4 ℃和25 ℃储存10 周后，25 ℃储存的活菌数明显较4 ℃少，尤其是1∶3.5 混合吸附的活菌数较其他混合比例低了9～18 倍。4 ℃条件下1∶2、1∶2.5 和1∶3 混合比例的活菌数差异不大。综合比较可知，制作I.orientalis淀粉吸附固态菌剂，淀粉比例过高不仅会导致初始死亡率升高，而且菌剂在后续储存过程中也存在大量死亡的现象。

由于功能强化曲制备过程使用生料接种，不可避免的会有杂菌存在。实验表明，加入一定量乳酸可以很大程度抑制杂细菌生长，同时不影响I.orien-talis的增殖。散料发酵或直接制成曲块均对I.orientalisP43的增殖影响不大。但散料发酵会导致细菌数量增加。在高接种量条件下，I.orientalis强化曲发酵6 d 后酵母活菌数可达到6～8 亿/g，活菌数量增加了80 倍。然而，自然晾干一个月后曲块的活菌数仅0.26 亿/g，这也说明I.orientalis不耐受低水分环境，水分散失越多，死亡率越高。

通过制备正丙醇含量低的功能菌剂和强化曲加大浓酱兼香型白酒中的原生优势酵母I.orientalisP43 的数量，可以通过竞争的方式影响发酵过程。使用复合功能强化曲替代25%大曲的生产实验在堆积过程中温度上升梯度和各项理化指标（水分、酸度、残糖等）均在工艺要求范围内。强化实验组原酒中正丙醇降低了27.4 %，乙醇含量提升了22.9%。采用强化曲替代部分大曲投入生产，所得三轮一次原酒品质和出酒率效果改善明显。