基于HPLC特征图谱和含量测定的仙鹤草药材质量控制研究

周湘媛 曹斯琼 孙冬梅 魏梅 潘礼业 陈向东 邓淙友 李振雨

摘要：目的 采用高效液相色谱法，建立仙鹤草药材的特征图谱和含量测定方法，为仙鹤草药材的质量控制提供参考。方法 特征图谱采用XSelect HSS T3（4.6×250mm，5μm）色谱柱;以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相，梯度洗脱，流速为1.0mL/min，检测波长为320nm，柱温为30℃，并进行相似度评价、聚类分析及主成分分析。采用XSelect HSS T3（4.6×250mm，5μm）色谱柱;以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相，等度洗脱，检测波长为254nm，柱温30℃，测定仙鹤草药材中槲皮苷的含量。结果 仙鹤草药材特征图谱有7个特征峰，除样品S20（河南产区）之外，不同产区的仙鹤草药材相似度均大于0.95;聚类分析将不同产地的仙鹤草药材分为3类，主成分分析显示，特征峰1、3、4和6是造成批次间差异的关键色谱峰;不同产地仙鹤草药材中槲皮苷含量范围为0.09%～0.22%，产地差异性较小。结论 所建立的HPLC特征图谱和含量测定方法可用于仙鹤草药材的质量控制。

关键词：仙鹤草;HPLC;特征图谱;槲皮苷;质量控制

中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2020）11-0056-07

【Abstract】Objective： To establish a characteristic map and content determination method of Agrimonia pilosa by HPLC and to provide reference for the quality control of Agrimonia pilosa. Methods： XSelect HSS T3 （4.6×250mm， 5μm） chromatographic column was used for the characteristic map. Acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution was as mobile phase， with gradient elution， 1.0mL/min flow rate， at 320nm detection wavelength and 30℃ of column temperature to carry out similarity evaluation， cluster analysis and principal component analysis. XSelect HSS T3 （4.6×250mm， 5μm） chromatographic column was used and acetonitrile -0.1% phosphoric acid solution as mobile phase， with socratic elution， at 254nm detection wavelength and 30℃ of column temperature to determine the content of quercetin in Agrimonia pilosa. Results： The characteristic map of Agrimonia pilosa has 7 characteristic peaks. Except for sample S20 （Henan production area）， the similarity of Agrimonia pilosa in different production areas was greater than 0.95. Agrimonia pilosa from different producing areas was divided into 3 kinds by cluster analysis. The principal component analysis showed that characteristic peaks 1， 3， 4 and 6 were the key chromatographic peaks that cause differences between batches. The content of quercetin in Agrimonia pilosa of different origins ranged from 0.09% to 0.22%， and the difference in origin was small. Conclusion： The established HPLC characteristic map and content determination method can be used for the quality control of Agrimonia pilosa.

【Key words】Agrimonia pilosa， HPLC， characteristic map， quercetin， quality control.

仙鶴草为蔷薇科植物龙芽草Agrimonia pilosa Ledeb.的干燥地上部分，具有收敛止血，截疟，止痢，解毒，补虚的功效[1]，临床常用于咯血，吐血，崩漏下血，疟疾，血痢，痈肿疮毒，阴痒带下，脱力劳伤[2]。现代研究表明，仙鹤草药用成分复杂，主要含有黄酮、三萜、异香豆素及有机酸类成分，具有抗炎、镇痛、抗氧化、降血糖、抗肿瘤等多种药理活性[3]。

2015年版《中国药典》对仙鹤草药材的质量控制仅收载鉴别和检查项，尚缺乏含量测定指标，文献对仙鹤草药材质量控制的研究较少，含量测定指标主要选择芹菜素、木樨草素等黄酮苷元类成分[4]，该类成分含量较低，缺乏专属性，且产地、采收加工等因素对药材的含量影响较大，不利于质量的控制[5]。本研究采用含量测定与特征图谱相结合的质量控制模式，通过采用高效液相色谱法，建立了仙鹤草药材的HPLC特征图谱，并对仙鹤草的主要有效成分槲皮苷进行定量分析，结合相似度计算及化学计量学分析方法，评价不同产地的仙鹤草药材质量，为仙鹤草药材的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1260 infinity高效液相色谱仪，CHEMSTATION C.01.04化学工作站（安捷伦公司），Waters高效液相色谱仪（e2695，沃特斯公司），百万分之一分析天平（XP26，梅特勒-托利多公司），十万分之一天平（ABT220-5DM，广州得翔科技有限公司），万分之一分析天平（ME204E，梅特勒-托利多公司），数控超声清洗器（KQ-500DE，昆山市超声仪器有限公司），超纯水机（MiliQ Direct 8，默克密理博公司），电热恒温水浴锅（HWS28，上海一恒科技有限公司）。

1.2 试药 甲醇、乙腈（默克股份有限公司），磷酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）为色谱级，水为超纯水（实验室自制），其余试剂为分析纯。槲皮苷对照品（批号：111538-201606，含量以90.6%计，中国食品药品检定研究院提供）;研究所用仙鹤草药材由广东一方制药有限公司采购管理部收集，经魏梅主任中药师鉴定分别为蔷薇科植物龙芽草Agrimonia pilosa Ledeb.的干燥地上部分，经检验，符合《中国药典》2015年版一部“仙鹤草”项下的有关规定，具体信息见表1。

2 方法与结果

2.1 仙鹤草特征图谱分析及标准建立

2.1.1 色谱条件 Waters XSelect HSS T3（4.6×250mm，5μm）色谱柱;流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～30min，22%～35%A;30～32min，35%A;32～33min，35～22%A;33～40min，22%A）;流速为每分钟1.0mL;柱温为30℃;检测波长为320nm;进样量为10 μl。

2.1.2 参照物溶液的制备 取槲皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含30μg的溶液，作为对照品参照物溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 取仙鹤草药材粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇50mL，密塞，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 方法学验证

2.1.4.1 专属性试验 取空白溶剂、“2.1.2”项下参照物溶液及“2.1.3”项下供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，供试品色谱中在与对照品参照物溶液色谱相应的保留时间处有相同的色谱峰，且空白溶剂无干扰，说明该方法专属性良好。

2.1.4.2 精密度试验 取“2.1.3”项下供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次，与槲皮苷参照物峰相应的峰为S峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

2.1.4.3 重复性试验 取药材粉末约0.5 g，按“2.1.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，与槲皮苷参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3.0%，表明该方法重复性良好。

2.1.4.4 稳定性试验 取“2.3”项下供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件分别在0、2、4、6、8、12、24小时进样分析，与槲皮苷参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3.0%，说明供试品溶液在24小时内稳定性良好。

2.1.5 HPLC特征图谱的构建与评价

2.1.5.1 特征图谱的建立 取25批仙鹤草药材，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”，以编号为S1样品的特征图谱为参照图谱，以3号峰为Mark峰进行保留时间校正，并进行全峰匹配，以平均数法生成对照特征图谱，见图1。

2.1.5.2 特征图谱结果分析 选择分离度较好、色谱峰纯度较高的7个共有峰为该特征图谱的特征峰，通过对照品指认出峰3为槲皮苷，以峰3为参照峰S，计算其他特征峰的相对保留时间和相对峰面积，25批仙鹤草药材峰1～峰7的相对保留时间均值为0.77（峰1）、0.96（峰2）、1.00（峰3）、1.13（峰4）、1.36（峰5）、2.07（峰6）、2.28（峰7）;

相对峰面积范围分别为0.316～0.712（峰1）、0.111～0.449（峰2）、1.246～3.303（峰4）、0.069～0.206（峰5）、0.564～4.211（峰6），0.078～0.198（峰7），结果见表2。

2.1.5.3 相似度评价 对25批仙鹤草药材特征图谱进行相似度评价，与对照特征图谱比较，除编号为S20的药材外，其余24批相似度均大于0.95，說明不同产地的仙鹤草药材整体质量比较稳定，相似度评价表见表3。

2.1.5.4 聚类分析 采用SPSS 20.0软件，以7个特征峰的峰面积为变量，采用组间联接方法对25批药材进行聚类分析，结果见图2，由结果可知，当判别条件距离为10时，25批仙鹤草药材被大致分为3类，第一类包括S1、S2、S3、S6、S8、S10、S11、S12、S13、S14、S15、S16、S17、S18、S19、S21、S22、S23、S24、S25，聚集了浙江、安徽、四川、河南、江苏5个产地的药材;第二类包括S4、S5、S7、S9，聚集了安徽、四川两个产地的仙鹤草药材;S20样品独自聚为一类，说明该批次药材与其他批次质量差异相对较大，与相似度评价结果相类似，该差异可能与药材的采收、产地加工等因素有关。

2.1.5.5 主成分分析 以7个特征峰的峰面积为变量进行主成分分析，以主成分特征值大于1为提取原则，根据表4的结果提取了2个主成分，累积貢献率达到82.88%，表明该2个主成分能代表7个共有峰在25批样品中82.88%的信息。根据主成分载荷矩阵系数（表5），

可以看出，峰1、峰4对主成分1的影响最大，峰3、峰6对主成分2的影响最大。以主成分1、主成分2的得分分别为横、纵坐标，生成25个样品主成分得分图，从图3和表6的结果中可以看出，编号为S20的仙鹤草药材主成分2得分值明显高于其他样品，离群也较远，编号为S4、S5、S7、S9的仙鹤草药材主成分1得分值明显高于其他样品，可以划为一类，其余20批药材归为一类，由于主成分1和2的主要贡献权重为峰1、3、4和6，因此，特征峰1、3、4、6为造成仙鹤草药材不同产地差异性的关键色谱峰。主成分分析同样将仙鹤草药材分为3类，这与聚类分析的结果一致。

2.2 槲皮苷含量测定

2.2.1 色谱条件 Waters XSelect HSS T3（4.6×250mm，5μm）色谱柱，以乙腈-0.1%磷酸溶液（23：77）为流动相;检测波长为254nm;进样量为10μl;理论板数按槲皮苷峰计算应不低于7000。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取槲皮苷对照品3.216mg，至25mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取仙鹤草药材粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇50mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 线性关系考察 精密吸取“2.2.2”项下对照品溶液，加甲醇分别制备浓度为3.64、7.28、14.57、29.14、58.27、116.55μg·mL-1的对照品稀释溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，以对照品浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，回归方程为Y=29.9060X-6.2115，r=0.9999。结果表明槲皮苷在浓度为3.64～116.55μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.2.5 精密度试验 精密吸取同一份对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，连续进样6次，测定槲皮苷对照品峰面积的RSD为0.27%，说明仪器精密度良好。

2.2.6 重复性试验 精密称取同一批样品6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，计算槲皮苷含量的RSD为0.57%，说明该方法重复性良好。

2.2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，分别于0、2、4、6、8、10、12、24h进样，测定槲皮苷峰面积的RSD为0.40%，说明供试品溶液在24小时内稳定。

2.2.8 加样回收试验 精密称定已知含量的仙鹤草药材粉末约0.25 g，共9份，分为3组，每组3份，分别按样品与对照品之比为1：0.5，1：1以及1：1.5的比例加入对照品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率。结果本方法准确度良好，平均回收率为96.92%，RSD为1.29%。

2.2.9 样品测定 取25批仙鹤草药材，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定并计算槲皮苷含量，结果见表7。结果显示，槲皮苷含量范围为0.09%～0.20%，最大值和最小值不超过3倍，说明不同产地仙鹤草药材槲皮苷的含量差异并不大，考虑到25批样品的代表性，若取含量均值的70%为下限来制定槲皮苷的含量限度标准，质量合格的仙鹤草药材中槲皮苷的含量应不低于0.10%。

3 讨论

3.1 样品制备及色谱条件考察 在特征图谱的构建过程中，以特征峰的总峰面积/称样量为考察指标，通过单因素分析，分别考察了提取溶剂、提取方式、提取时间和溶剂用量对仙鹤草特征图谱的影响，最终确定以50%乙醇50mL作为提取溶剂，加热回流30分钟作为样品的前处理方法。考察了乙腈-0.1%磷酸，甲醇-水，甲醇-0.1%磷酸3种流动相的洗脱效果，结果显示，以乙腈-0.1%磷酸为流动相，色谱峰信息量最大，基线较平稳;考察仙鹤草不同吸收波长（320nm、254nm、280nm、360nm）下的特征图谱，结果显示，在320nm下各特征峰的整体吸收较高，故选用320nm为检测波长。

3.2 特征峰的指认及特征图谱标准的确立 仙鹤草药材特征图谱共有7个特征峰，采用对照品比对及光谱分析，确认特征峰3为槲皮苷，以峰3为S峰，采用相对保留时间进行定位，各特征峰的相对保留时间分别为0.77（峰1）、：0.96（峰2）、1.13（峰4）、1.36（峰5）、2.07（峰6）及2.28（峰7），为严格控制仙鹤草质量，对各特征峰的相对峰面积设定限量标准，考虑到25批样品的代表性，取各特征峰相对峰面积的最低、最高值，规定特征峰1～7的相对峰面积范围，分别为0.316～0.712（峰1），0.111～0.449（峰2），1.246～3.303（峰4），0.069～0.206（峰5），0.564～4.211（峰6）及0.078～0.198（峰7）。

3.3 聚类分析和主成分分析 聚类分析将25批药材分成3类，其中编号S4、S5、S7、S9的药材为一类，S20独自聚成一类，其余20批药材为一类。利用主成分分析法，将7个特征峰变量降维为2个主成分变量，确定影响仙鹤草药材分类的关键色谱峰为峰1、峰3、峰4及峰6，编号为S4、S5、S7、S9和S20的样品，因峰1、峰3、峰4及峰6的峰面积与其他20批差异较大，因此各成一类，这种差异可能与药材的采收或产地加工有关。

3.4 含量测定 槲皮苷具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、降血脂等多种药理作用[6]，是仙鹤草的主要有效成分之一，研究显示，相较于其他黄酮类，该成分在仙鹤草中含量较高，稳定性较好[7]，因此，选择槲皮苷作为仙鹤草的含量测定指标。研究显示，25批仙鹤草药材的槲皮苷含量范围为0.09%～0.22%，且最大值与最小值不超过3倍，表明不同产地仙鹤草药材槲皮苷的含量较稳定，不同产地之间差异性较小。

本研究建立的特征图谱和含量测定方法重现性良好，样品制备简单，分析时间短。采用特征图谱结合含量测定能更好地评价仙鹤草的质量，为仙鹤草的质量标准的提升提供参考。

参考文献：

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（收稿日期：2020-05-27）