视网膜Müller细胞中谷氨酸受体2的表达分析

杨 梅，胡秋梅，黄艳明

(1.陆军军医大学第二附属医院眼科，重庆 400037；2.陆军军医大学大坪医院眼科，重庆 400042)

α-氨基-3羧基-5甲基-4异恶唑丙酸受体(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid receptor，AMPAR)是一类离子型谷氨酸受体(Glutamate receptors，GluR)，由谷氨酸受体GluR1、GluR2、GluR3、GluR4 4个亚单位组成，在细胞的粗面内质网中形成[1]。其中，GluR2有阻止钙离子通道开放的作用，在基因表达、RNA编辑、AMPAR的合成和运输方面均起到重要的调控作用[2-3]。有研究认为，如果神经元的GluR2表达下降，其更容易受到谷氨酸神经毒性的损伤[3]。因此，GluR2是神经保护的重要调节靶点，已经成为了该领域研究的热点。研究显示，在视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell，RGC)、无长突细胞、双极细胞等神经元中均有GluR2的表达，且其在神经元树突棘的形成、突触的形成及神经元的存活中均发挥着重要的病理生理作用[4-6]。除了神经元外，视网膜中还有大量的神经胶质细胞，包括小胶质细胞、星型胶质细胞、Müller细胞等，对维持视网膜的结构和功能也起着重要的作用。其中，Müller细胞是视网膜中数量最多的胶质细胞，是连接RGC与微环境之间的桥梁，对RGC有重要的营养支持和神经保护作用[7-8]。但关于Müller细胞中有无GluR2表达尚未可知。本研究主要探讨GluR2在Müller细胞中的表达情况，旨在为视网膜胶质细胞的神经保护功能提供新的研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

新生(1～2 d)的SD大鼠由陆军军医大学第二附属医院医学中心实验动物中心提供。本实验经陆军军医大学实验动物福利伦理审查委员会批准，批准号：SCXK(PLA)20120031。主要试剂：高糖DMEM培养基(Hyclone公司，美国)，胎牛血清(BI公司，以色列)，0.25%胰蛋白酶(Gibco公司，美国)，小鼠抗波形蛋白(Vimentin)单克隆抗体、兔抗GluR2多克隆抗体、小鼠抗GAPDH单克隆抗体(Abcom公司，英国)，DAPI(上海碧云天公司，中国)，荧光二抗(594)标记羊抗小鼠IgG(Thermo公司，英国)，RNA提取及逆转录试剂盒(Promega公司，美国)。

1.2 方法

1.2.1 Müller细胞原代培养 参考本课题组前期发表的文献进行SD新生大鼠视网膜Müller细胞原代培养[9]。新生大鼠腹腔注射4.3%的水合氯醛麻醉后，断头处死，无菌操作取出眼球后浸泡在高糖DMEM+1%双抗的培养基中，于37 ℃、5%CO2培养过夜。0.25%胰蛋白酶液消化1 h，加入含10%胎牛血清的DMEM终止消化，在高倍显微镜下分离视网膜，加入DMEM完全培养基(含1%双抗、10%胎牛血清)，反复吹打，制成细胞悬液，用70 μm滤网过滤，调整细胞密度按3×105/mL接种于培养瓶中，于37 ℃、5%CO2孵箱中培养，第2天换液，继续培养6～8 d，细胞密度达到80%时予以传代，细胞传至3～4代可进行后续实验。

1.2.2 免疫荧光染色Vimentin鉴定Müller细胞纯度[9-10]4%多聚甲醛固定细胞15 min，PBS缓冲液洗3次，每次5 min；0.1%Triton打孔15 min，PBS缓冲液洗3次，每次5 min；10%山羊血清封闭30 min。加入一抗(小鼠抗Vimentin单克隆抗体、兔抗GluR2多克隆抗体)，4 ℃过夜，PBS缓冲液洗3次，每次5 min；加入荧光二抗(1∶300)，室温避光孵育1 h，PBS缓冲液洗3次，每次5 min，DAPI染色15 min。Vimentin是Müller细胞的特异性蛋白，Vimentin阳性表达的细胞即为Müller细胞，Müller细胞纯度=Vimentin阳性细胞数/DAPI总数×100%。

1.2.3 Real-Time PCR检测GluR2 mRNA表达 参照文献[11]提取RNA，按Takara试剂盒(RR047A，日本)说明书逆转录成cDNA。依次加入无核酸酶、高纯水2 μL，Mix 5 μL，oligol(dT)18引物，上下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，GAPDH作为内参。GluR2上游引物序列：AATCTCCTCCTACACGGCTAACTT，下游引物序列：GACTCTGGCTACTCCTTCTGC；GAPDH上游引物序列：GACATCAAGAAGGTGGTGAAGC，下游引物序列：TGTCATTGAGAGGACCTGCCAGC，所有引物购于重庆擎科生物技术有限公司。qPCR反应条件：预变性95 ℃、10 min，变性95 ℃、15 s，循环39次，退火57 ℃、1 min，延伸65 ℃、5 min，Bio-RAD CFX Maestro软件(美国)对Real-Time PCR结果进行相对定量。

1.2.4 Western blot检测GluR2蛋白表达 文献报道大鼠的脑皮质有GluR2 mRNA和蛋白表达[12-13]，因此本研究将其作为阳性对照组，传代培养到第3代的Müller细胞作为实验组。具体方法参考文献[14]，配制8% SDS-PAGE胶，以40 μg/μL的蛋白浓度上样电泳，转至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，分别加入一抗(兔抗GluR2多克隆抗体1∶5 000，小鼠抗GAPDH单克隆抗体1∶5 000)，4 ℃摇床孵育过夜。分别加入二抗，室温孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min，ECL显色，Omega Lum G凝胶成像仪曝光，GAPDH作为内参，分别用Image J软件测量GluR2条带和GAPDH条带的灰度值，GluR2蛋白表达OD值=GluR2条带灰度值/GAPDH条带灰度值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 传代培养的Müller细胞中GluR2免疫荧光表达

Müller细胞免疫荧光纯度鉴定结果显示，原代培养的Müller细胞传至3代后，95%以上的细胞可表达Müller细胞的特异性蛋白Vimentin，细胞纯度>95%，见图1a。Müller细胞免疫荧光双染色结果显示，同一细胞中有Vimentin和GluR2 2种荧光阳性表达，GluR2的荧光主要表达在细胞膜及胞浆中(图1b)。

a:Müller细胞纯度鉴定；b：Müller细胞的Vimentin和GluR2共染色 绿色：Vimentin；红色：GluR2；DAPI：核(蓝色)图1 Müller细胞免疫荧光染色

2.2 Müller细胞中GluR2 mRNA和蛋白表达

Real-Time PCR结果显示，阳性对照组GluR2 mRNA相对表达量为(100±17.34)%，实验组为(86.47±19.23)%，2组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图2a。Western blot结果显示，阳性对照组GluR2蛋白相对表达量为(100±14.28)%，实验组为(82.82±11.34)%，2组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图2b、c。

a:GluR2 mRNA表达；b和c：GluR2蛋白表达图2 Müller细胞中GluR2 mRNA和蛋白表达水平

3 讨论

视网膜中主要有3种神经胶质细胞，即小胶质细胞、星型胶质细胞和Müller细胞，其中，Müller细胞数量最多，也是视网膜中特有的，具有重要的病理、生理作用的细胞，一直是视网膜、视神经等疾病研究的热点。Müller细胞横跨整个视网膜组织，维持着视网膜的基本结构，是视网膜整个内环境的重要组成部分，可以调控细胞外谷氨酸的浓度及pH，维持RGC所处视网膜的整个微环境平衡[15]。Müller细胞分泌的神经生长因子，如脑源性神经营养因子、睫状神经营养因子、胰岛素样生长因子等，对视网膜中的神经元具有重要的神经保护和促进再生作用[16]。而Müller细胞的过度胶质激活又会形成胶质瘢痕，从而进一步损伤与之密切接触的视网膜神经元，造成RGC等细胞的死亡、轴突再生困难等。

GluR1、GluR2、GluR3、GluR4的跨膜区和胞外结构非常相似，但是胞质侧的C端却不完全相同，由于C端可以和不同的蛋白相互作用，因此这4种亚单位所发挥的作用也不同[17]。有研究表明，GluR2具有较低的钙离子通透性，而GluR1、GluR3、GluR4则具有较高的钙离子通透性[18]。而在一些视网膜疾病中，这 4种亚单位表达也有差异。有研究在糖尿病视网膜病变动物模型中发现，内外丛状层GluR2的表达增加，而GluR1的表达没有明显变化[19]。以上结果说明，GluR2在某些视网膜疾病中是一个特殊的病理角色，进一步研究其病理机制具有重要的意义。

本研究首次发现原代培养的视网膜Müller细胞有GluR2的表达，虽然其表达水平较脑皮质组织水平稍低，但鉴于Müller细胞在视网膜中的重要地位，我们推测，Müller细胞的GluR2可能也具有十分重要的病理、生理作用，但需要进一步从分子机制、信号通路、物质交换等多层面研究探讨。