RNA N6- 甲基腺嘌呤异常修饰影响肿瘤干细胞促进恶性肿瘤发生、发展的研究进展

朱正阳 *，王 成*，姜辰一，赵福军 ,

1. 上海交通大学附属第一人民医院泌尿外科，上海200080；2. 上海交通大学附属第一人民医院临床医学院，上海200080；3. 南京医科大学附属上海市第一人民医院临床医学院泌尿外科，上海200080； 4. 新疆维吾尔自治区喀什地区第二人民医院泌尿外科，喀什 844000

近年来，RNA表观遗传修饰相关调节分子及其作用机制在恶性肿瘤中的作用逐渐被认知。各类RNA修饰都能对疾病的发生、发展产生一定影响，其中RNA N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）异常修饰及其修饰相关分子的异常表达与白血病、乳腺癌、神经胶质瘤等多种恶性肿瘤的发生、进展相关[1]。然而，其中的机制仍未完全阐明。在RNA m6A异常修饰促进恶性肿瘤进展、复发和治疗抵抗的过程中，肿瘤干细胞可能发挥关键作用。

肿瘤干细胞理论的核心在于恶性肿瘤细胞具有异质性和层级结构：具有干性的恶性肿瘤细胞逐级分化生成异质性肿瘤细胞，或者分化较好的肿瘤细胞去分化为肿瘤干细胞，进而介导肿瘤的发生、发展[2]。研究[3]表明肿瘤干细胞能通过调节微环境、自噬等多种机制逃避免疫监视及避免氧化磷酸化来抵抗治疗。一定比例的肿瘤干细胞还能在放射治疗和化学治疗中保持静息态以降低细胞损伤，并在治疗后重新进入细胞周期，导致肿瘤复发[4]。

恶性肿瘤细胞在层级分化或去分化的过程中，表观遗传改变及其相关调控分子的异常表达常常促进肿瘤恶化。作为RNA表观遗传修饰的重要形式之一，RNA m6A异常修饰是否能影响肿瘤干细胞在抗肿瘤治疗中的抗性，进而引起肿瘤进展和复发？本文即以肿瘤干细胞为纽带，综述了相关研究进展，以探讨mRNA m6A修饰与肿瘤发生、发展之间的联系。

1 RNA m6A修饰

表观遗传修饰广泛存在于DNA、RNA中，其中RNA的表观遗传修饰极其丰富。近年来已发现N1-甲基腺嘌呤（N1-methyladenosine，m1A）、N5-甲基胞嘧啶（N5-methylcytosine，m5C）、N7-甲基鸟嘌呤（N7-methylguanine，m7G）、m6A、2′-O-甲基化（2′-O-methylation，2′OME）等多种修饰[5]。m6A修饰是较常见的RNA表观遗传修饰形式，一般发生于高度保守的RNA区域，在mRNA的终止密码子、3′端非翻译区（untranslated region，UTR）以及长外显子处富集。

1.1 RNA m6A修饰的调控

RNA m6A修饰在人体组织内广泛存在且高度保守。m6A修饰可逆，由甲基转移酶样蛋白3（methyltransferaselike protein 3，METTL3）、METTL14与其调控蛋白肾母细胞瘤1-相关蛋白（Wilms tumor 1-associating protein，WTAP）、病毒样m6A甲基转移酶相关蛋白（vir like m6A methyltransferase associated，VIRMA）、RNA 结合基序蛋白 15（RNA-binding protein 15，RBM15）、 锌 指 CCCH域 蛋 白 13（zinc finger CCCH domain-containing protein 13，Zc3H13）组成的甲基转移酶复合体催化修饰，由去甲基化酶脂肪和肥胖相关蛋白（fat mass and obesityassociated protein，FTO）、α- 酮戊二酸依赖型加双氧酶同源 物 5（α-ketoglutarate-dependent dioxygenase homolog 5，ALKBH5 ）催化去除修饰，受m6A结合蛋白YTH结构域家族蛋白1/2/3（YTH domain-containing family protein 1/2/3，YTHDF1/2/3）、胰岛素样生长因子2 mRNA 结合蛋白1/2/3（insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 1/2/3 ，IGF2BP1/2/3）等读取并调节。真核细胞内RNA m6A修饰由甲基转移酶复合体在核内完成，复合体核心由METTL3、METTL14组成，其中METTL3是催化核心，METTL14起协同、稳定作用[6-7]。WTAP是其主要调控蛋白，能够促进复合体合成，介导其募集[8]。VIRMA可以影响WTAP的功能，RBM15、Zc3H13能够促进WTAP定位于特定的核内mRNA[5,9]。去甲基化酶FTO、ALKBH5均属于Fe（Ⅱ）和α- 酮戊二酸依赖型加双氧酶（α-ketoglutarate-dependent dioxygenase，AlkB）家族，都以单链RNA为主要底物。FTO可以催化单链RNA中的m6A氧化去甲基化，ALKBH5则能够直接将m6A转化为腺苷，并且抑制被修饰的mRNA出核转运、代谢，促进其加工因子聚集[10-11]。YTHDF和IGF2BP可以读取m6A修饰，进而影响mRNA的翻译、转运、剪切、分解等[6,9]。

1.2 RNA m6A修饰的功能

作为RNA的主要修饰方式，多种重要生理功能的调节与m6A修饰有关。细胞层面上，m6A修饰参与调控各种RNA的加工、降解及翻译。组织层面上，m6A修饰参与特定组织的分化、发育，还会影响能量平衡的调节。在人乳腺癌细胞（MDA-MB-231）中敲减METTL3导致成熟微小RNA（microRNA，miRNA）合成水平降低[12]；FTO与METTL3共同调节3′UTR长度和RNA可变剪切[13]。在卵母细胞中敲除YTH （YT521-B homology） 结构域蛋白 1（YTH domain-containing 1，YTHDC1）可导致mRNA可变剪切出现严重缺陷[14]。m6A修饰参与RNA可变剪切的调节，在外显子剪切增强子区域的m6A修饰促进富含丝氨酸/精氨酸剪接因子2（serine/arginine-rich splicing factors 2，SRSF2）与mRNA结合，能够增加外显子表达[15]。m6A修饰参与RNA翻译，位于3′或5′UTR的m6A修饰可以与翻译起始因子真核起始因子3（eukaryotic initiation factor 3，eIF3）、80 kDa核帽结合蛋白（80 kDa nuclear cap-binding protein，CBP80）和真核起始因子4E（eukaryotic initiation factor 4E，eIF4E）相互作用，促进RNA翻译启动[16]；YTHDF1促进核糖体与m6A修饰的mRNA结合，促进翻译[17]；YTHDF3配合YTHDF1、YTHDF2发挥作用，并在m6A修饰驱动的环状RNA（circular RNA，circRNA）翻译初始阶段起作用[18-19]。m6A修饰降低mRNA稳定性，参与RNA降解，YTHDF2介导m6A修饰的mRNA降解[20]。m6A修饰影响T细胞稳态，m6A修饰通过白细胞介素7（interleukin-7，IL-7） /信号转导及转录激活蛋白5（signal transducer and activator of transcription 5，STAT5）/细胞因子信号抑制物（suppressor of cytokine signaling，SOCS）通路控制T细胞稳态，m6A修饰的减少抑制幼稚T细胞增殖分化，维持细胞自我更新[21]。m6A修饰调节精子形成，其缺失会导致二倍体精原细胞生成精子受阻[22]。m6A修饰影响胚胎发育，通过抑制干性基因如NANOG、性别决定相关基因簇 2（sex determining region Y-box 2，SOX2）以及IGFBP的mRNA的稳定性，进而促进各类谱系标志物表达，诱导胚胎干细胞分化[23]；转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）也能通过 m6A修饰依赖途径促进神经外胚层发育[24]。m6A修饰帮助细胞产生热休克应激，在热休克应激下，m6A可以优先修饰于应激诱导转录的热休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）mRNA的5′UTR处，促进非cap依赖型翻译的启动[25]。

2 m6A异常修饰与肿瘤发生、发展

m6A修饰不仅生理作用丰富，其异常修饰在恶性肿瘤的发生和进展中也起到了相当重要的作用。并且m6A修饰在不同类型的肿瘤细胞中可以发挥完全相反的作用。

一些研究显示，m6A修饰的异常下调可能促进肿瘤发生与进展。在急性髓细胞性白血病（acute myelocytic leukemia，AML）患者携带基因突变的造血细胞中，FTO过表达促进异常造血细胞增殖，抑制细胞凋亡[26]。FTO减少致癌基因MYC的mRNA 5′端及外显子中的m6A修饰，抑制YTHDF2介导的RNA降解，提高对应蛋白质表达，促进肿瘤发生[27]。在急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）的异常造血细胞中，FTO抑制锚蛋白重复序列与SOCS盒蛋白2（ankyrin repeat and SOCS box protein 2，ASB2）和视黄酸受体α（retinoic acid receptor α，RARA）表达，增强致癌基因介导的细胞转化和白血病发生[26]。在肺鳞状细胞癌中，FTO促进髓样锌指蛋白1（myeloid zinc finger 1，MZF1）表达，进而抑制细胞凋亡，促进癌细胞增殖、侵袭[28]。在肝细胞癌中，METTL14下调导致miR-126的前体RNA上m6A修饰减少，造成DiGeorge综合征危象区蛋白8（DiGeorge syndrome critical region 8，DGCR8）对其识别和结合的能力下降，使参与肿瘤转移的成熟miR-126水平明显下调，促进肿瘤转移[29]。在黑色素瘤中，FTO的异常上调使C-X-C趋化因子受体4（C-X-C chemokine receptor type 4，CXCR4）和SOX10的转录片段m6A修饰减少，抑制YTHDF2介导的转录片段降解，促进蛋白质表达，介导肿瘤的发生、发展[30]。

与之相对应，另一些研究报道m6A修饰的异常上调也会导致肿瘤发生。在AML中，携带基因突变的造血细胞中异常增多的METTL14和METTL3分别提高致癌基因MYB、MYC和BCL2、PTEN的转录片段 m6A修饰水平，增加其表达，促进白血病干细胞增殖、自我更新，抑制骨髓分化[31-32]。在肝细胞癌中，METTL3上调导致SOCS2 转录片段m6A过度修饰，更易被YTHDF2识别降解，使SOCS2对酪氨酸受体激酶（tyrosine-protein kinase，JAK）/STAT通路的抑制减弱，导致肿瘤增殖[33]。在乳腺癌中，乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白（hepatitis B virus X-interacting protein，HBXIP）阻碍miRNA let-7g生成，增加METTL3表达，而高表达的METTL3进一步提高HBXIP的转录片段 m6A修饰水平，增加HBXIP表达，从而形成正反馈，促进肿瘤发生[34]。在胃癌中，METTL3异常增多提高AKT的磷酸化水平，促进AKT信号通路，介导下游效应子核糖体蛋白S6激酶（ribosomal protein S6 kinase，p70S6K）和细胞周期蛋白D1（cyclin D1）表达，提高胃癌细胞增殖性和侵袭性[35]。在肺腺癌中，METTL3异常增多提高了表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）和TAZ（tafazzin）蛋白表达，促进癌细胞生长、侵袭[36]。在结直肠癌中，METTL3异常增多提高致癌基因SOX2的转录片段编码区（coding DNA sequence，CDS）的m6A修饰水平，促进转录片段被胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2（insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 2，IGF2BP2）识别，提高其稳定性，促进肿瘤生长[37]。在骨肉瘤中，METTL3提高淋巴增强子结合因子1（lymphoid enhancer-binding factor 1，LEF1）的转录片段 m6A修饰水平，促进LEF1表达，激活Wnt/β-catenin通路，促进肿瘤发生[38]。此外，m6A还可以影响肿瘤免疫，促进肿瘤进展。m6A可以通过IL-7/STAT5/SOCS通路影响T细胞稳态，从而影响肿瘤患者免疫力[21]。

3 RNA m6A异常修饰与肿瘤干细胞

3.1 RNA m6A异常修饰与肿瘤干细胞的形成与维持

肿瘤细胞存在异质性，肿瘤在增殖过程中内部进化出不同性质的细胞类型，其中具有干性、可以自我更新和不对称分裂、进而分化形成其他瘤内细胞的细胞亚群即是肿瘤干细胞。

在前文中，我们介绍了m6A修饰的异常上调破坏NANOG、SOX2、IGFBPs等干性基因mRNA片段的稳定性，从而诱发胚胎干细胞分化[5]。在肿瘤发生与发展过程中，很可能存在相反的过程，即m6A修饰在干性促进基因的转录片段上异常下调，促进基因表达，介导体细胞或分化较好的肿瘤细胞去分化，进而形成肿瘤干细胞。虽然目前对于肿瘤干细胞如何形成的认识不足，尚未有实验直接支持这一猜想，但是m6A修饰促进致癌基因表达，促进肿瘤干细胞增殖、分化，从而促进肿瘤进展、复发的过程与其具有相似性。在乳腺癌中，缺氧微环境通过缺氧诱导因子 1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）提高ALKBH5表达，使干性因子NANOG、KLF4的转录片段去甲基化，从而避免m6A修饰介导的mRNA降解，使干性因子表达增加[39]。类似地，缺氧微环境通过HIF提高锌指蛋白217（zinc finger protein 217，ZNF217）表达，抑制METTL3对KLF4转录片段的m6A修饰，从而提高转录片段的稳定性[39]。抑制m6A修饰使肿瘤细胞干性基因表达增加，最终可能去分化成为肿瘤干细胞，由此可见，m6A修饰极有可能参与肿瘤干细胞形成。

m6A修饰通过对RNA剪切、加工、翻译的密切影响参与维持肿瘤干细胞的自我更新。在神经胶质瘤干细胞中，METTL3或METTL14的异常下调导致胞内m6A修饰水平整体降低，进而引起致癌基因ADAM19、EPHA3和KLF4表达上调，抑癌基因CDKN2A、BRCA2和TP53I11表达下调，促进了肿瘤干细胞的肿瘤形成和自我更新[40-41]。ALKBH5的高表达降低m6A修饰水平，使非m6A修饰的细胞周期调控因子叉头框M1（forkhead box protein M1，FoxM1）的转录片段被人抗原R（Hu-antigen R，HuR，ELAV1）蛋白结合，增加FoxM1转录片段的稳定性，促进FoxM1蛋白的表达，从而提高了肿瘤干细胞的增殖和自我更新能力[42]。因此，RNA m6A修饰在肿瘤干细胞形成及维持过程中可能起到非常重要的作用。

3.2 RNA m6A异常修饰与肿瘤干细胞相关的肿瘤复发

作为肿瘤细胞层级制度的初级细胞，肿瘤干细胞是肿瘤放射治疗和化学治疗抵抗和治疗后复发的重要原因。肿瘤干细胞导致肿瘤复发可能通过以下2种机制：一方面，治疗时部分肿瘤干细胞通过休眠、微环境改变或自身调节等极大降低甚至规避损伤；另一方面，治疗后肿瘤干细胞的自身损伤修复，使其重新进入细胞增殖分裂周期。

肿瘤干细胞可以通过调节自身膜受体和跨膜转运系统降低化学治疗带来的损伤。研究[43]发现，过表达ATP结合盒（ATP-binding cassette，ABC）的肿瘤干细胞可以在化学治疗后进一步增殖。ABCB1的过表达给予肿瘤干细胞多种耐药性，包括对秋水仙碱、阿霉素、依托泊苷、长春碱和紫杉醇的抗性[44-45]。神经母细胞瘤高表达ABCG2和ABCA3转运体，排出药物的能力提高[3]。也有研究[46]表明，CD44高表达的胃癌细胞中Hedgehog通路蛋白与化学治疗耐药性有关。

肿瘤干细胞可以通过调节代谢减少抗肿瘤治疗引起的氧化损伤。氧化损伤的主要机制是氧化磷酸化和脂质过氧化。肿瘤干细胞可以通过提高糖酵解率和增加活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除剂表达来抵抗氧化磷酸化引起的氧化损伤。转移性黑色素瘤通过叶酸途径增加还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）生成，还原氧化型谷胱甘肽，提高谷胱甘肽水平，从而清除ROS，减轻氧化应激[47]。肝癌肿瘤干细胞则通过过表达CD13清除ROS[48]。肿瘤干细胞中，乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase，ALDHs）合成增加可以降低脂质过氧化产物水平，减轻氧化应激，还可以保护肿瘤干细胞不受烷基化剂的影响，从而增加对环磷酰胺、紫杉醇等的耐药性[3]。

肿瘤干细胞还可以通过调节组织微环境降低化学治疗带来的损伤。肿瘤干细胞生存在壁龛（niche）中，壁龛是维持和赋予干细胞活性的特殊微环境。壁龛有利于细胞通过黏附连接和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）进行细胞间交流。ECM通过整合蛋白（integrin）、旁分泌素（paracrine）、近分泌素（juxtacrine）和激素信号、机械传感和神经信号传递信息。肿瘤干细胞可以使相邻的成纤维细胞转变为肿瘤相关成纤维细胞，调节壁龛组织微环境，利于肿瘤增殖和浸润[49]。肿瘤干细胞亚群中，一部分细胞处于休眠态，因而可以避免抗肿瘤治疗造成的损伤。放射治疗和大部分化学治疗仅对增殖中的肿瘤细胞有效，而研究[4,50]发现，胶质瘤和乳腺癌中约1/3的肿瘤干细胞处于休眠态，并且在治疗后可以重新进入细胞周期。

除了通过维持肿瘤干细胞数量、促进其增殖间接对抗放射治疗和化学治疗，m6A修饰也参与肿瘤干细胞对抗肿瘤治疗的直接抵抗。在神经胶质瘤干细胞中，METTL3下调导致SOX2 转录片段的m6A修饰水平降低，促进HuR与SOX2转录片段结合，提高其稳定性，增加SOX2表达。SOX2进一步激活DNA修复通路，提高胶质瘤干细胞的自我修复能力，降低放射治疗敏感性[51]。在宫颈癌中，FTO的上调使β-catenin mRNA的m6A水平降低，促进β-catenin表达，进而介导上皮间质转化以及核苷酸切除修复调节子ERCC1（excision repair cross-complementing 1）表达[52]。在结直肠癌中，YTHDF1过表达增强了Wnt/β-catenin通路，从而提高肿瘤细胞自我修复能力[53]。由于肿瘤干细胞往往是放射治疗和化学治疗抵抗的关键，可见RNA的表观修饰提高了宫颈癌干细胞和结直肠癌干细胞的自我修复能力及放射治疗和化学治疗抵抗。不难看出，RNA的m6A修饰主要通过提高肿瘤干细胞自我修复能力对抗治疗。然而，又有研究[26]发现，在APL中，FTO降低ASB2和RARA的mRNA UTR区m6A修饰水平，从而降低其mRNA稳定性，进而减少其蛋白质表达，导致全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）诱导的细胞分化被抑制，ATRA疗效降低。

4 展望

肿瘤细胞异质性是恶性肿瘤的特征之一，肿瘤干细胞仅占肿瘤的一小部分，而其他肿瘤细胞无法实现不断自我更新，或者自我更新能力被剥夺。在肿瘤干细胞促进恶性肿瘤发生、进展和复发的过程中，以m6A异常修饰为代表的RNA表观修饰很可能起到了至关重要的作用。因此，以m6A和肿瘤干细胞为切入点，探索控制肿瘤进展、抑制肿瘤复发的治疗靶点，是未来研究的重要方向之一。