液相色谱富集分离再造烟叶生产浓缩蒸发冷凝液中的香味成分

张利涛，李华雨*，田泱源，王毅博

1.河南卷烟工业烟草薄片有限公司技术中心，河南省许昌市金叶大道666号461000

2.北京理工大学珠海学院材料与环境学院，广东省珠海市香洲区金凤路6号519088

再造烟叶生产过程中，烟草原料经过水三级逆流提取，提取液浓缩后涂布在基片上形成产品。国内再造烟叶生产企业在浓缩工艺段大多采用多效浓缩蒸发器或蒸汽机械再压缩蒸发器［1］，在提取液浓缩过程中，有30%以上的烟草香味成分进入浓缩蒸发冷凝液中［2］，另外，提取液浓缩时温度在55～85℃之间，有助于发生不同程度的美拉德反应［3］。因此，浓缩蒸发冷凝液中富含烟草香味成分，富集分离这些香味成分对于再造烟叶品质提升具有重要意义。中压制备色谱的操作压力低（0～1.38 MPa），主要用于产品的分离与纯化［4］。大孔吸附树脂是不含交换基团且有大孔结构的高分子吸附树脂，具有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，可选择性吸附水溶液中的有机物，目前已在环保［5］、食品［6］、医药［7］等领域得到广泛应用。近年来，国内外有关茶叶和葡萄酒在浓缩过程中香味成分的回收已有研究报道［8-11］，但再造烟叶浓缩蒸发冷凝液中烟草香味成分的回收研究鲜见报道。为此，利用中压制备色谱及大孔吸附树脂，将浓缩蒸发冷凝液中的香味成分富集、分离并制备成含有不同烟草香味成分的乙醇溶液，以期为再造烟叶浓缩蒸发冷凝液中不同烟草香味成分的富集、分离提供一种方法，并为再造烟叶产品的内在质量提升提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

河南卷烟工业烟草薄片有限公司某品牌产品生产时的浓缩蒸发冷凝液；X-5大孔吸附树脂（郑州勤实科技有限公司）。

二氯甲烷、丙酮（AR，郑州派尼化学试剂厂）；无水硫酸钠（AR，天津市福晨化学试剂厂）；氯化钠（AR，天津市德恩化学试剂有限公司）；乙酸苯乙酯（标准品，99.3%，美国Sigma公司）；无水乙醇（≥99.7%，郑州派尼化学试剂厂）；实验用水为蒸馏水。

Reveleris X2 Flash中压制备色谱仪［内置蒸发光散射（ELSD）和紫外检测器，美国Grace公司］；气相色谱-飞行时间质谱仪（GC/TOFMS）（美国Leco公司）；自动进样器（美国Gerstel公司）；0.22 μm有机相针头过滤器（天津富集色谱技术发展公司）。

1.2 方法

1.2.1 浓缩蒸发冷凝液富集分离条件

流动相A为蒸馏水，B为无水乙醇；梯度洗脱：0～30 min内B溶液由0升高至100%，保持10 min；流速：20 mL/min；检测波长：UV1为220 nm、UV2为254 nm、UV3为280 nm；平衡时间：2 min；收集瓶体积：25 mL；收集瓶数量：25个；收集模式：收集所有溶液。

1.2.2 内标溶液的配制

准确称取1.045 g乙酸苯乙酯，用乙醇溶解，并定容至100 mL，置于4℃冰箱中保存。

1.2.3 样品处理与分析

（1）浓缩蒸发冷凝液。量取50 mL浓缩蒸发冷凝液置入500 mL分液漏斗中，分3次向分液漏斗中加入60 mL二氯甲烷进行香味成分萃取；合并萃取液，加入15μL内标溶液及适量无水硫酸钠，置于冰箱中干燥过夜；过滤，将萃取液在46℃水浴中浓缩至2.0 mL，用有机滤膜过滤；进行GC/TOFMS分析。

（2）柱后流出液。量取600 mL柱后流出液置入1 000 mL分液漏斗中，处理方法同浓缩蒸发冷凝液。

（3）含水的回收溶液。量取9 mL回收溶液放入100 mL分液漏斗中，分3次向分液漏斗中加入9 mL二氯甲烷进行香味成分萃取；合并萃取液，加入15μL内标溶液及适量无水硫酸钠，在4℃冰箱中过夜；用有机滤膜过滤，进行GC/TOFMS分析。

（4）不含水的回收溶液。量取9 mL回收溶液，加入15μL内标溶液及适量无水硫酸钠，于4℃冰箱中过夜，用有机滤膜过滤，进行GC/TOFMS分析。

（5）GC/TOFMS分析条件。色谱柱：Rxi-5sil MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；进样口温度：250℃；载气：高纯氦气；载气流速：1.0 mL/min；炉温平衡时间：1 min；进样方式：分流进样；分流比：50∶1；进样量：1μL；升温程序：50℃280℃（5 min）；电离方式：EI；电离能量：70 eV；采集速率：10 spec/s；检测器电压：1 550 V；离子源温度：250℃；传输线温度：280℃；扫描离子范围：35～600 amu；溶剂延迟：3 min；质谱扫描方式：全扫描模式；平滑谱图所需点数：6；峰宽：6 s。

对样品中的香味成分利用NIST08标准谱库进行检索，相似度800以上的化合物结合烟草中含有物质的相关文献［12-18］定性分析，特征峰作为定量离子，特征离子的峰面积作为相对量的参考，各化合物相对量采用化合物峰面积与内标物峰面积比值处理。

1.2.4 富集分离溶液的感官评价

将富集分离的溶液按照0.5%添加到再造烟叶丝中，采用YC/T 530—2015［19］的方法对回添了富集分离溶液的再造烟叶进行感官质量评价。

2 结果与讨论

2.1 浓缩蒸发冷凝液中香味成分的富集、分离和制备

将40 g树脂在丙酮中浸泡过夜后慢慢装入填充柱，压紧，利用中压制备色谱仪依次用200 mL乙醇和200 mL蒸馏水活化柱子，以80 mL/min流速将4 L浓缩蒸发冷凝液加载到填充柱，收集柱后流出液，然后以不同比例的乙醇水溶液洗脱，洗脱梯度见1.2.1节。图1为梯度洗脱时富集分离溶液的瓶号及紫外吸收、ELSD谱图。

图1富集分离溶液样品的紫外吸收光谱和蒸发光散射谱图Fig.1 UV absorption and ELSD evaporative light-scattering spectra of enriched and separated solution samples

根据图1紫外吸收及ELSD谱图，把富集分离的溶液分为6段，表1为富集分离溶液的分段、每 段溶液的保留时间，对应图1中的瓶号及富集分离溶液的体积。

表1富集分离溶液的保留时间及体积Tab.1 Retention time and volume of enriched and separated solution

2.2 富集分离溶液的香味成分分析

2.2.1 Ⅰ段富集分离溶液

Ⅰ段富集分离溶液的GC/TOFMS总离子流图谱见图2，共鉴定出24种香味成分，测定的化合物见表2。可知，富集分离出的呋喃类及其衍生物种类较多，其中呋喃类化合物2种、呋喃醛类2种、呋喃醇类2种、呋喃酮类8种，呋喃类化合物是具有特殊气味的一类物质［17-18］；苯甲醇及苯乙醇相对量较高，芳香醇类化合物是烤烟挥发油中最重要的具有较平和花香味的物质［18］；2-乙酰基吡咯相对量高，呈花香韵，是对烟草香气有一定作用的物质［17］。

图2Ⅰ段富集分离溶液的总离子流色谱图Fig.2 Total ion current chromatogram of enriched and separated solution from SectionⅠ

表2Ⅰ段富集分离溶液中香味成分的相对量①Tab.2 Relative contents of aroma components in enriched and separated solution from SectionⅠ

2.2.2 Ⅱ段富集分离溶液

收集的Ⅱ段富集分离溶液GC/TOFMS总离子流图谱见图3，共鉴定出71种香味成分，见表3。可知，富集分离出的香味成分较多，尤其是含氮杂环类、酸类、酚类及烷烃类化合物。含氮杂环类化合物共19种，其中吡嗪类化合物8种，以二取代和三取代吡嗪为主，相对量均较低。吡啶类化合物6种，其中2,3'-联吡啶相对量高。有机酸类化合物15种，约占此富集分离溶液总挥发成分的5.6%，其中戊酸、己酸及十六酸相对量较高，甲基丁酸、苯甲酸、苯乙酸次之。酚类化合物8种，其中2,4-二叔丁基苯酚相对量依然较高，其次是2-甲氧基-4-乙烯基苯酚。脂肪烃类化合物15种，占此溶液总挥发成分的23.6%，酮类化合物8种，异佛尔酮及2,6,6-三甲基-2-环己烯-1,4-二酮的相对量高，醇类化合物3种，但相对量均较高。

2.2.3 Ⅲ段富集分离溶液

图3Ⅱ段富集分离溶液的总离子流色谱图Fig.3 Total ion current chromatogram of enriched and separated solution from SectionⅡ

表3Ⅱ段富集分离液中香味成分的相对量Tab.3 Relative contents of aroma components in enriched and separated solution from SectionⅡ

表3（续）

Ⅲ段富集分离溶液GC/TOFMS总离子流图谱见图4，共鉴定出25种香味成分，见表4。可知，富集分离出的化合物主要为酮类和酯类，其中酮类12种，异 佛 尔 酮、3-羟 基-α-大 马 酮 及9-羟基-4,7-巨豆二烯-3-酮相对量较高；酯类4种，但二氢猕猴桃内酯的相对量非常高，占此富集分离溶液中总挥发成分的36.7%。1-甲基-4-（1-甲基乙烯基）环己醇的相对量高，占溶液中总挥发成分的27.6%。其他如酚类、酸类、烯类、烯醛类及呋喃类化合物种类少且相对量也较低。

图4Ⅲ段富集分离溶液的总离子流色谱图Fig.4 Total ion current chromatogram of enriched and separated solution from SectionⅢ

表4Ⅲ段富集分离溶液中香味成分的相对量Tab.4 Relative contents of aroma components in enriched and separated solution from SectionⅢ

2.2.4 Ⅳ段富集分离溶液

Ⅳ段富集分离溶液GC/TOFMS总离子流图谱见图5，共鉴定出18种香味成分，见表5。可知，Ⅳ类富集分离出的化合物主要为高级脂肪醇、萜醇类及少部分的酮类化合物，其中2-甲基-1-十一醇及2-甲基-5-辛炔-4-醇的相对量高，醇类化合物占此溶液总挥发成分的28%；回收成分中茄尼酮等3种酮类化合物相对量均较高，其他如酸类、酚类、氧杂环类及酯类化合物种类少且相对量较低。

图5Ⅳ段富集分离溶液的总离子流色谱图Fig.5 Total ion current chromatogram of enriched and separated solution from SectionⅣ

表5Ⅳ段富集分离溶液中香味成分的相对量Tab.5 Relative contents of aroma components in enriched and separated solution from SectionⅣ

2.2.5 Ⅴ段富集分离溶液

保留时间在21.0～27.0min时，紫外220、254及280 nm均有较强的紫外吸收，在25.0～27.0 min时蒸发光谱图也有吸收峰，因此Ⅴ段富集分离溶液包括了2部分溶液，分别进行了GC/TOFMS分析，图6为2部分溶液的总离子流色谱图，共鉴定出31种香味成分，见表6。可知，Ⅴ段富集分离出的化合物主要为类胡萝卜素的降解产物，酮类共15种，其中可增加烟草花香香味的关键致香成分β-大马酮相对量非常高，占此溶液总挥发成分的46%，茄尼酮及6,10-二甲基-5,9-十一双烯-2-酮的相对量也比较高，巨豆三烯酮的4个同分异构体均在此解析溶液中。高级脂肪酸有3种，氧杂环化合物有2种，相对量均比较高，其他如醇、醛、烯及酯类化合物种类少且相对量较低。

表6Ⅴ段富集分离溶液中香味成分的相对量Tab.6 Relative contents of aroma components in enriched and separated solution from SectionⅤ

图6Ⅴ段富集分离溶液的总离子流色谱图Fig.6 Total ion current chromatogram of enriched and separated solution from SectionⅤ

表6（续）

2.2.6 Ⅵ段富集分离溶液

保留时间在27.0～31.5 min时，紫外与蒸发光均无吸收，GC/TOFMS分析结果显示（图7）富集分离溶液中不含致香成分。31.5～35.0 min有一较大的220 nm紫外吸收及蒸发光色谱峰（图1），GC/TOFMS分析结果显示，保留时间在26.67 min处有一相对丰度较大的峰，分析其成分为植醇，占溶液总挥发成分的61.1%，植醇具有清香、轻度辛辣味道［18］，其他成分有降植烯及植物呋喃（表7）。

图7保留时间27.0～31.5 min及Ⅵ段富集分离溶液的总离子流色谱图Fig.7 Total ion current chromatogram of and enriched and separated solution from SectionⅥat retention time of 27.0-31.5 min

表7Ⅵ段富集分离溶液中香味成分的相对量Tab.7 Relative contents of aroma components in enriched and separated solution from SectionⅥ

2.3 富集分离溶液的感官质量评价

以再造烟叶丝为对照，回收溶液按照0.5%添加，感官评价结果见表8。Ⅰ类回收溶液中富含呋喃类、呋喃类衍生物及芳香醇类化合物，可增加烟香。Ⅱ类回收溶液中富含吡嗪类、吡啶类等氮杂环化合物，增加产品的烟味厚实感，富含酸类、酚类及高级烷烃类化合物，使产品偏酸性，增加产品润度。Ⅲ类回收溶液中富含酮类和酯类化合物，二氢猕猴桃内酯含量高，酮类化合物增加甜香，二氢猕猴桃内酯增加烟香。Ⅳ类回收溶液中含较多的高级脂肪醇类、萜醇类及少量酮类化合物，使产品透发性较强、清新感稍增。Ⅴ类回收溶液中富含类胡萝卜素的降解产物，此类产物与香气质呈极显著正相关且正面影响较大［20］。Ⅵ类回收溶液中植醇含量高，增加产品清香感。成分的分析结果与添加产品后的感官评价结果一致。表8说明不同的富集分离溶液对再造烟叶产品具有不同的作用，优化使用可以提升产品的内在质量。

表8 6段富集分离溶液的感官质量评价描述Tab.8 Description of sensory quality evaluation of enriched and separated solutions from six sections

2.4 浓缩蒸发冷凝液中香味成分的回收率

4 L浓缩蒸发冷凝液加载到柱子后，收集柱后流出液约4 L，按照1.2.3节处理和分析样品，以［1-（柱后流出液峰面积总和×浓缩蒸发冷凝液中内标的峰面积）/（12×浓缩蒸发冷凝液峰面积总和×柱后流出液中内标的峰面积）］计算香味成分的回收率为83.51%，说明填料富集回收浓缩蒸发冷凝液中香味成分的回收率良好。

3 结论

①利用X-5大孔吸附树脂富集再造烟叶浓缩蒸发冷凝液中的烟草香味成分，回收率为83.51%。②利用中压制备色谱及大孔吸附树脂可根据产品需求将浓缩蒸发冷凝液中的烟草香味成分富集分离为6段含有不同香味成分的溶液。③以再造烟叶丝为对照品，对富集分离的6段溶液进行感官评价，6段富集分离溶液对再造烟叶产品感官质量具有不同的正向作用，均可提升产品的内在质量。