体外受精-胚胎移植患者黄素化起始前后激素水平差异对累积助孕结局影响的研究

张多多，甄璟然，王含必，郁琦，邓成艳

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院妇科内分泌与生殖中心，北京 100730)

性激素水平对IVF/ICSI的促排卵治疗有重要的监测和指导作用，在促排卵的不同阶段往往会关注不同性激素的变化，目前已经对于促排卵期间卵泡期的不同性激素增减趋势有了较为充分的认识[1-2]，但是关于促排卵在扳机后的黄素化改变研究较少。经典的卵巢周期性激素理论认为在排卵前12 h左右孕酮、雄烯二酮和雌二醇的水平都在增长，但排卵后孕酮水平继续升高而雄烯二酮和雌二醇水平出现短暂下降[3-4]。而实际促排卵过程有别于自然周期，我们观察到在扳机后一天患者的雌二醇水平增减表现不一，孕酮虽然整体呈增长趋势，但增幅也不近相同[5]。为了进一步明确这一问题，我们设计了如下研究，旨在探索促排卵患者在基础状态及扳机前后血清促性腺激素与性激素水平的增减变化和变化幅度是否与助孕结局存在关系。

资料和方法

一、研究对象

本研究回顾性纳入了北京协和医院2014年7月1日至2018年3年31日期间的IVF/ICSI 取卵周期，促排卵均使用GnRH激动剂卵泡期长方案，共4 176周期。研究伦理编号S-K601。

研究仅纳入盆腔-输卵管因素或男方因素不孕的患者，排除了GnRH激动剂扳机的周期、胚胎未使用完的周期、赠卵周期，以及无法随访到产科结局的患者。

二、治疗过程

进入IVF治疗流程后于月经周期第2天抽血查基础性激素水平，该时刻激素水平称为基础值(T0时刻)。降调节后20 d左右，满足血清FSH<5 U/L、E2<183.5 pmol/L，无大于10 mm的卵泡时，开始使用重组人FSH(rFSH，果纳芬，默克雪兰诺，瑞士)启动，正常反应人群启动剂量为每日rFSH 150～225 IU，根据患者的年龄、BMI以及卵巢储备情况个体化增减。促排卵过程中，依据患者的卵巢反应性，rFSH剂量可以增减或更换为HMG(贺美奇，辉凌，德国)。当出现至少3个卵泡直径≥17 mm时，注射 250 μg重组HCG(rHCG，艾泽，默克雪兰诺，瑞士)扳机，扳机当天清晨抽血查性激素六项(T1时刻)，扳机后第一日清晨(约扳机后12 h，T2时刻)再次抽血查性激素六项，扳机后36 h左右取卵。

IVF/ICSI授精后16～18 h评估2个原核的出现情况，之后每日观察胚胎发育的情况直至第3天卵裂期胚胎(D3胚胎)移植。依据文献报道方法为所有正常受精的胚胎评分[6-7]。在取卵后第3天，得分最高的胚胎进行新鲜移植，剩余的胚胎进行囊胚培养并玻璃化冷冻保存。

冻融胚胎移植(FET)采用人工周期或自然周期内膜准备，于添加孕激素起的第4天或排卵后的第3天移植D3卵裂期胚胎；或添加孕激素起的第6天或排卵后的第5天移植囊胚。黄体支持方案为以阴道内黄体酮缓释凝胶(雪诺同，默克雪兰诺，瑞士)90 mg qd为基础，可联用口服地屈孕酮片(达芙通，雅培，荷兰)10～20 mg qd，直至孕10周左右逐渐停药。

三、性激素检测指标

血清FSH、LH、E2、孕酮(P)和睾酮(T)水平使用自动化 Elecsys化学发光法(Beckman，美国)。检测体系内部的变异程度分别为：E2<5%，P和T均<10%，FSH和LH均<8%。先对比五种性激素在T0、T1和T2时刻的绝对数值及其变化，又进一步对比了T2相对于T1时刻的上述五种性激素变化幅度。

四、结局指标

本研究的结局观测指标为累积临床妊娠率(cumulative clinical pregnancy rate)和累积活产率(cumulative live birth rate)。“累积”是指一次IVF促排取卵周期获得所有胚胎移植后的累积结局，包括新鲜周期和解冻移植周期。临床妊娠是指超声下观测到胎心搏动；活产是指大于28周的活产。

五、统计学分析

本研究的数据统计由SPSS 24.0 软件完成。通过Kolmogorov-Smirnov 检验(P=0.01)来评估连续性资料的正态性。连续正态分布资料使用(均数±标准差)来描述分布，非正态连续变量使用中位数(四分位数)M[P25，P75]来描述分布。两组独立的连续性变量使用t检验或者Mann-WhitneyU检验来比较。重复测量资料采用双因素重复测量的方差分析进行统计。所有的统计量均使用双尾检验，定义有统计意义为P<0.05。

结 果

一、促排卵不同时间点性激素水平与妊娠结局关系

最终符合条件的3 009个IVF/ICSI周期纳入分析。其中，2 098个IVF周期，911个ICSI周期。

按照妊娠结局(有或无累积妊娠、有或无累积活产)分组：有累积妊娠者1 585人，无累积妊娠者1 424人；有累积活产者1 381人，无累积活产者1 628人。我们分别对照了不同妊娠结局人群的FSH、LH、E2及T四种性激素在T0、T1及T2时刻的变化水平(表1～5)。

对于妊娠结局较好(有累积妊娠或累积活产者)的一组，各检测时间点FSH水平均更低(P<0.001)(表1)；妊娠结局较好组LH基础值水平稍高(P<0.05)，之后均显著低于妊娠结局较差组(无累积妊娠或无累积活产者)(P<0.001)(表2)。不同妊娠结局组E2基础值无显著差异(P>0.05)，之后两个检测时间点妊娠结局较好组E2水平更高(P<0.001)(表3)。妊娠结局较好组在任何检测时间点均有更高的T水平(P<0.001)(表4)。由于本院患者缺少基础状态P水平数据，只对比了T1及T2时刻，妊娠结局较好组扳机后(T2时刻)的P水平更高(P<0.001)(表5)。

表1 不同妊娠结局组3个时间点FSH水平比较[U/L，M(P25，P75)]

表2 不同妊娠结局组3个时间点LH水平比较[U/L，M(P25，P75)]

表3 不同妊娠结局组3个时间点E2水平比较[pmol/L，M(P25，P75)]

表4 不同妊娠结局组3个时间点T水平比较[nmol/L，M(P25，P75)]

表5 不同妊娠结局组两个时间点P水平比较[nmol/L，M(P25，P75)]

二、性激素增幅差异与累积妊娠结局的关系

为进一步对比在扳机日(T1)和扳机后一天(T2)性激素的改变情况，我们将T2与T1激素水平的差值(△T=T2-T1)在有或无累积妊娠以及有或无累积活产这两个结局之间的差异进行对比。扳机后一天相比扳机日对比(△T)，不同妊娠结局患者间FSH的变化均无统计学差异(P>0.05)；有累积活产的患者相比无累积活产的患者LH下降更加明显(P<0.05)；在两种妊娠结局中，有累积妊娠或活产者E2、P和T的增量均显著更高(P<0.001)(表6)。

表6 不同妊娠结局组扳机后一天(T2)与扳机日(T1)激素水平变化比较[-(sd)]

讨 论

我们的研究观察到对于妊娠结局较好(有累积妊娠/累积活产)的人群相比于妊娠结局较差(无累积妊娠/累积活产)的人群在扳机日扳机后一天，FSH和LH的水平均较低，而雌二醇、孕酮和总睾酮水平显著较高。对比各项激素水平在这两天增量的绝对值，妊娠结局较好的一组雌二醇、孕酮和总睾酮在扳机后一天相比于扳机日的绝对增幅均显著大于妊娠结局较差的一组，而有累积活产的人群LH的下降幅度稍明显，FSH的变化未见明显的差异。

经过GnRH激动剂长方案降调节后，血FSH的浓度基本反映了患者接受rFSH注射的量。如果将获卵数分为<5枚、5～15枚和>15枚，可以发现三个组每个卵平均接受的rFSH暴露量分别为484 IU、218 IU和89 IU[8]，也就是rFSH暴露剂量越小，获卵数就越多。另外已有研究证实，大剂量的FSH暴露会削弱胚胎的种植潜力[9]。这与我们妊娠结局较好的一组人群中在扳机日和扳机之后一天FSH都较结局较差一组更低是一致的。而相同量的LH作用下，LH受体表达量越大，颗粒细胞对LH的敏感性越强[10]。我们认为妊娠结局较好的一组患者中颗粒细胞对LH有更好的敏感性，所以LH水平低于结局较差组，而扳机后LH下降的也更快，妊娠结局较好组的孕酮水平和增量都更高，也反映了卵泡内细胞的LH敏感性更好。

有学者对促排卵多卵泡发育状态下猴的围排卵期甾体代谢途径进行了探索，发现在HCG扳机后的12 h内低密度脂蛋白(LDL)受体mRNA表达一过性升高，而在24～36 h降至基础水平，提示扳机时触发了一过性的甾体合成底物胆固醇的旺盛需求；甾体代谢的限速酶侧链裂解酶(P450scc)的mRNA表达在0～24 h内下降，之后在36 h逐渐上升至原水平；而3β类固醇脱氢酶(3β-HSD)的mRNA浓度在HCG扳机后12 h内增加了17倍，提示黄素化后雌激素开始由Δ5途径合成向Δ4、Δ5途径共同合成发生转化；而芳香化酶的活性始终保持稳定[11]。我们推测妊娠结局好的一组患者可能在底物水平有更丰富的胆固醇进入甾体代谢或限速酶P450scc有更高的活性或浓度，所以在扳机后第一天约12 h查血清雌二醇水平会更高；或者这种更高的水平的甾体代谢也可能原因是更多的卵泡发育时 的累积作用，造成更多的雌激素的分泌。而睾酮是Δ5途径的代谢产物脱氢表雄酮经3β脱氢酶催化而成的雌二醇的前体物质，所以在妊娠结局较好的一组患者中雌二醇与睾酮的绝对值及增量都更大[11-12]。同样也有研究观察到，在自然周期中如果在临近排卵前出现雌二醇水平的增长平台或略降低(10%以内)，可能与即将发生提早排卵或卵子质量差相关[13]，这从反面论证了我们观察到雌二醇增量大的患者助孕结局更佳。对15 000个初次取卵周期的观察得出累积活产率随获卵数增加而逐渐升高，在获得≥25颗卵时达到70%，超过27枚卵之后累积活产率又继续增加了5.1%[14]。可见获卵数越多，累积活产率就越大。因为雌二醇的水平及扳机后孕酮升高的水平与成熟卵泡的数量相关，所以雌孕激素水平都与累积妊娠率与累积活产率相关。

在我们的患者中，妊娠结局较好的一组，不论在扳机日还是扳机后一天都有更高的孕酮水平，这与晚卵泡期孕酮水平升高造成对妊娠结局的负面影响并不矛盾。首先我们两组患者的孕酮均值均小于孕酮对妊娠结局产生不良影响的界值1.5 ng/ml(4.77 nmol/L)[15]；另外，我们纳入的是一般人群，既往研究观察到在低反应患者中晚卵泡期孕酮水平的升高会显著的影响继续妊娠率，而在正常反应人群中却未见这种影响[16]。我们发现在扳机后一天孕酮较扳机日的增量在有累积妊娠/累积活产组中更高，这与另一项研究的观察具有一致性，该研究观察到在使用HCG扳机的人群中，取卵日相比于扳机日，获卵越多的患者孕酮增量越大，作者认为这与这些患者颗粒细胞有更好的LH敏感性相关，黄素化反应更加充分[8]。

本研究的局限性在于所有的数据均来自于卵巢功能相对正常的不孕人群，及输卵管因素和男方因素，不涉及排卵障碍及子宫内膜异位症等卵巢功能异常的患者。所以本研究的结果能否用于其他不孕人群尚待进一步探索。此外，本研究虽然涉及了基础状态、扳机及扳机后一天3个特殊时间点，但扳机后一天并不能完全代表黄素化之后的完整情况，只能说明早期黄素化的早期状态。

综上，我们的研究系统且全面的对比了在GnRH激动剂长方案促排卵的多卵泡发育状态下，常见性激素水平及其增长趋势与累积妊娠结局存在密切关系。扳机及扳机后一天更高的甾体性激素水平提示更好的辅助生殖结局。