彩超联合血清血清抗甲状腺球蛋白抗体、抗甲状腺过氧化物酶抗体、B型RAF基因V600E在诊断多灶性甲状腺乳头状癌的应用价值

廖观生,王晓龙,徐波,吴立旋

(1.广州医科大学附属广州市第一人民医院甲状腺外科; 2.惠州市中心人民医院甲状腺外科，广东 广州 510180)

甲状腺癌是临床常见恶性肿瘤疾病，其中甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)占甲状腺癌比例较高，而多灶性甲状腺乳头状癌(Multifocal papillary thyroid carcinoma，MPTC)是其常见类型，近年患病率呈不断上升趋势[1]。甲状腺癌早期诊治可取得良好的预后状况，而晚期甲状腺癌恶性程度较高，患者预后状况较差[2]。因此，对MPTC等甲状腺癌尽早进行准确诊断和鉴别诊断可为其早期干预以及预后的改善提供依据。彩超可应用于甲状腺癌诊断，此外，甲状腺球蛋白抗体(Antithyroglobulin antibody，TGAb)、抗甲状腺过氧化物酶抗体(Anti-thyroid peroxidase antibody，TPOAb)、B型RAF基因V600E(Type B RAF gene V600E，BRAFV600E)突变等亦与甲状腺癌密切相关[3-5]。本研究分析彩超联合血清TGAb、TPOAb、BRAFV600E在诊断MPTC的应用价值，旨在为MPTC诊断方案的选择及其早期诊治提供依据，具体的研究方法以及结果如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

以2016年6月至2019年6月惠州市中心人民医院收治的甲状腺癌805例为研究对象，纳入标准：患者就诊时触诊查体可触及甲状腺腺体内出现质硬结节，表面粗糙，可伴随吞咽动作而上下活动，部分可触及颈部肿大淋巴结，均初次在惠州市中心人民医院就诊治疗并经活检病理检查确诊甲状腺癌，知情同意，其中同时具有≥2个病灶病例为多灶癌。

排除标准：排除复发病例、合并其他系统疾病或肝肾功能障碍患者等。以其中106例MPTC为A组，4例甲状腺髓样癌(MTC)患者为B组，剩余695例甲状腺乳头状癌(PTC)为C组。研究符合伦理学标准，且患者均签署了知情同意书。三组基线资料比较见表1，差异均无统计学意义(P>0.05)，有可比性。

1.2 观察指标以及检测方法

1.2.1彩超检查 对A组、B组和C组进行彩超检查，检查采用仪器为美国GE公司的GE logiq 9 超声仪，探头频率为9.0MHz～14MHz，检测采用仰卧位，患者头部后仰或向左右侧偏以暴露需检查部位，通过直接扫描法进行检查。甲状腺癌诊断标准：病灶低回声，边界形态不规格，伴有弥漫性不规格微细钙化病灶，病灶内部血管粗大且走形杂乱，血流丰富，高速流值(Vmax)和阻力指数(RI)均出现增高，可出现颈部淋巴结肿大，其中砂粒样微钙化、低回声和病灶内部血流丰富是特异性诊断依据。

表1 三组基线资料比较

1.2.2血清TGAb、TPOAb检测 检测A组、B组和C组的血清TGAb、TPOAb阳性率，三组入组后均取静脉血，肝素抗凝管手机血液样本，3 500 r/min转速、3 cm半径离心10 min，分层后去上层血清，通过化学发光法检测血清TGAb、TPOAb水平，检测采用仪器为德国西门子 ADVIA Centaur XP 全自动化学发光免疫分析仪，配套试剂盒均优西门子公司生产提供，严格按照仪器和试剂盒说明书要求进行检测操作。其中高于60 U/mL为血清TGAb、TPOAb阳性标准。

1.2.3BRAFV600E基因突变状况检测 检测A组、B组和C组的BRAFV600E基因突变状况，检测试剂提供和引物设计均由上海生工生物工程有限公司完成。取活检样本制成的厚度为8 μm切片5片，二甲苯处、无水乙醇处理后在70 ℃环境中干燥，300 μLTE缓冲液消化并水浴过夜，DNA纯化试剂盒和凝胶回收试剂盒手机总DNA，经紫外分光光度计260 nm波长下比色，标化DNA浓度为300 ng/μL。常规行PCR检测，上游引物：5′-GTAACTCAGCAGCATCTC-3′；下游引物：5′-TTCCTTTACTTACTACACCT-3′，共204 bp。25 μL PCR扩增体系包括2.5 μL的10×PCR缓冲液、1.0 μL的模板(空白对照组采用ddH2O)、2.0 μL的25 mmol/LMg2+、1.5 μL的1 mmol/L dTNP、0.2 μL(1U)的Taq酶(Promega公司)、1.0 μL的10 mmol/L 上游引物、1.0 μL的10 mmol/L 下游引物、17.2 μL的ddH2O。OCR反应条件为95 ℃预变性0.5 min、95 ℃变性5 min、52 ℃退火0.5 min、72 ℃延伸0.5 min，循环40次后72 ℃延伸5 min。PCR产物经琼脂凝胶电泳及Quantity One凝胶成像分析系统检测条带后进行DNA测序。DNA纯化测序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成，多组单向测序发现突变或可以突变后再分别进行单向测序，确定突变样本，行反向测序验证结果。

1.3 统计学方法

采用SPSS 24.0软件进行数据的统计学分析；计数资料比较采用卡方检验；多组计量资料比较采用方差分析并通过SNK-q检验进行进一步的两两比较；采用多因素Logisitic分析血清TGAb阳性、TPOAb阳性、BRAFV600E基因突变是否为MPTC的高危因素；以活检结果为金标准，诊断试验四格表分析单独应用彩超检查、血清TGAb、TPOAb阳性以及BRAFV600E基因突变在MPTC诊断中的应用价值以及四者联合诊断MPTC的价值；当P<0.05时，差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组血清TGAb、TPOAb阳性率以及BRAFV600E基因突变率比较

A组血清TGAb、TPOAb阳性率以及BRAFV600E基因突变率均高于B组和C组(P<0.05)；B组和C组血清TGAb、TPOAb阳性率以及BRAFV600E基因突变率比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 MPTC高危因素的多因素Logisitic分析

多因素Logisitic分析结果显示，血清TGAb阳性、TPOAb阳性、BRAFV600E基因突变等均是MPTC的高危因素。见表3。

2.3 彩超检查、血清TGAb、TPOAb阳性以及BRAFV600E基因突变单独以及联合应用在MPTC诊断中的价值分析

相对于单独应用于MPTC诊断，彩超联合血清TGAb、TPOAb阳性以及BRAFV600E基因突变联合诊断MPTC的敏感度、特异度和准确性均提高，漏诊率和误诊率则均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表2 三组血清TGAb、TPOAb阳性率以及BRAFV600E基因突变率比较[例(%)]

表3 MPTC高危因素的多因素Logisitic分析

表4 彩超检查、血清TGAb、TPOAb阳性以及BRAFV600E基因突变单独以及联合应用在MPTC诊断中的价值分析

3 讨论

甲状腺癌是常见头颈部内分泌恶性肿瘤，其发病率近年来呈上升趋势，以PTC为最为常见的类型，PTC占甲状腺癌的60%～80%[6,7]。同时性具有两个或两个以上病灶的PTC为MPTC，MPTC是较为常见的PTC类型，占PTC发病率的18%～87%[8]。而本研究中，801例PTC患者中106例为MPTC，MPTC占PTC发病率的13.23%(106/801)，略低于报道比例但差异不大，总体符合MPTC发病占比。MPTC的临床特征主要为多发病灶，与淋巴结转移状况、治疗效果、复发状况等均有关系，亦是影响患者预后的重要因素[9]。甲状腺癌的发生受到性别、年龄、种族、碘摄入等多种因素的影响，其早期及时诊治可获得较好的预后状况[10]。因此，对甲状腺癌进行及时有效的诊治十分必要。

甲状腺彩超检查是甲状腺癌术前常规检查，可辅助诊断甲状腺癌，其高频探头应用可清晰显示甲状腺内部的微小结构、血管和血流状况等，可检测出2mm以上的微小病变，可有效提高甲状腺癌的术前诊断率[11-12]。本研究中，彩超检查诊断MPTC的敏感度、特异度、准确性、漏诊率和误诊率分别为80.19%、74.39%、75.16%、19.81%和25.61%，其总体敏感度、特异度、准确性较好，但漏诊率和误诊率都高达约20%，彩超诊断MPTC价值有待提高。

TGAb、TPOAb是自身免疫性甲状腺疾病重要检测项目，与甲状腺组织损伤以及甲状腺功能异常密切相关，亦有研究表明其与甲状腺癌发生发展以及颈部淋巴结转移有关[13-14]。本研究中，多因素Logisitic分析结果显示，血清TGAb阳性、TPOAb阳性均是MPTC的高危因素，诊断试验四格表分析结果显示，血清TGAb阳性诊断MPTC的敏感度、特异度、准确性、漏诊率和误诊率分别为80.19%、75.54%、76.15%、19.81%和24.46%，血清TPOAb阳性诊断MPTC的敏感度、特异度、准确性、漏诊率和误诊率分别为76.42%、76.39%、76.40%、23.58%和23.61%，两者用于MPTC辅助诊断具有一定的价值，但漏诊误诊较多，有待进一步提高。

BRAFV600E基因突变在PTC中较为常见，可达29%～83%，主要出现在散发型甲状腺癌体细胞中，甲状腺癌其他亚型以及甲状腺良性肿瘤病变中较少发生[15]。BRAFV600E基因突变与甲状腺癌密切相关，可影响甲状腺的生长、浸润、去分化等多个过程，因而其在甲状腺癌诊断、治疗、靶向治疗等中检测应用均具有一定的价值[16]。本研究中，BRAFV600E基因突变在PTC出现概率为30.94%而在MPTC中出现概率为78.30%，与前人研究报道一致。本研究中，多因素Logisitic分析结果显示，BRAFV600E基因突变等是MPTC的高危因素之一，而诊断试验四格表分析结果显示，BRAFV600E基因突变诊断MPTC的敏感度、特异度、准确性、漏诊率和误诊率分别为78.30%、69.10%、70.31%、21.70%和30.90%，其用于MPTC辅助诊断具有一定的价值，但亦存在较明显的漏诊和误诊状况。

本研究亦分析彩超检查、血清TGAb、TPOAb阳性以及BRAFV600E基因突变联合检测在MPTC诊断中的应用价值，结果显示，超联合血清TGAb、TPOAb阳性以及BRAFV600E基因突变联合诊断MPTC的敏感度、特异度、准确性、漏诊率和误诊率分别为95.28%、97.42%、97.14%、4.72%和2.58%。相对于单独应用于MPTC诊断，彩超联合血清TGAb、TPOAb阳性以及BRAFV600E基因突变联合诊断MPTC的价值更佳，且漏诊和误诊少，更适用于MPTC的诊断和鉴别诊断。

综上所述，彩超、血清TGAb、TPOAb阳性以及BRAFV600E基因突变联合诊断MPTC的价值良好且漏诊误诊少，可用于MPTC早期诊断和鉴别诊断，为其早期治疗干预和获得良好的预后状况提供基础。