UM171+SR1结合细胞分群体外高效扩增造血干细胞的探究

陈嘉欣,林丽苹,周观清,范勇

(广州医科大学附属第三医院妇产科,广东广州 510150)

造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)具有分化为体内各种成熟血液细胞的潜能，是维持机体内血液稳态的重要组成部分。造血干细胞不仅能分化为各种血液细胞，同时具有自我更新能力[1]。因此，造血干细胞移植是临床治疗恶性血液系统疾病的重要治疗方案。目前造血干细胞的主要来源有骨髓，动员的外周血及新生儿脐带血[2]。因其来源不同，获得的造血干细胞数量不一致，但都有数量不足的缺点，并且在目前的体外培养体系下，造血干细胞会迅速失去干性，得到的细胞质量满足不了临床移植的需求。因此，如何在获得造血干细胞后，体外成功扩增培养并维持其干性成为亟需解决的问题。

近年来，由于化学小分子化合物合成技术的提高，相关小分子的研发成为体外扩增造血干细胞的研究重点，随着测序的高速发展，有关造血干细胞调控机制的研究也愈加充分，如氧化代谢调控、糖代谢水平、嘌呤代谢和氨基酸代谢等机制对造血干细胞的自我更新、多向分化潜能具有重要作用[3]。许多针对相关信号通路的促造血干细胞扩增小分子逐渐被合成， 但由于稳定性及毒性的研究并不充分，这些靶向小分子暂未能运用于临床治疗。目前，UM171[4]和SR1(StemRegenin)[5]这两个小分子被认为是较为成熟稳定的造血干细胞体外扩增剂，且经一段时间的体外扩增培养后的细胞仍具有较强干性[6]。

经过扩增培养的细胞，需要鉴定其性质与干性维持程度，使用免疫缺陷小鼠做体内移植实验，其周期通常需要12周以上，且费用昂贵，因此不能将其用为常规检测方法。流式细胞技术为我们提供了简单可行的方式，通过细胞表面抗体，对扩增后细胞进行富集和检测。CD34作为研究比较充分的抗体，一直以来都是作为鉴定造血干细胞的首要筛选标志[7]。近年来多项研究表明，CD133表面抗原，在维持干性的造血干细胞中阳性比例较高[8]，其不仅适用于筛选高干性的脐带血来源的造血干细胞，也同样适用于筛选胎肝以及自体外周血细胞来源的造血干细胞[9]，在经体外扩增一段时间后CD34+CD133+细胞可在免疫缺陷小鼠体内成功移植并重建人造血系统[10]，使其可成为筛选具有多潜能干性的造血干细胞的流式抗体。CD34+CD133+造血干细胞群不单只是单一细胞群，研究表明CD34lowCD133low的肝脏细胞可以促进CD34highCD133high造血干细胞的增殖[11]，扩增后的CD34highCD133high造血干细胞仍维持了在小鼠体内重建血液系统的能力并可实现二次移植。

1 材料与方法

1.1 材料

足月分娩胎儿的脐带血由广州医科大学附属第三医院妇产科产妇捐赠，产妇签署知情同意书和捐赠协议。无遗传性家族疾病史和先天性疾病史，孕期体检正常，产前情况未见明显异常。

1.2 试剂与仪器

StemSpanTMSFEM II 、EasySepTMHuman Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II、LymphoprepTM、SepMateTM-50、EasySepTMBuffer、MethoCultTMH4034 Optimum均购自加拿大STEMCELL 公司；Human Hematopoietic Stem Cell Expansion Cytokine Package(IL-6)购自美国PeproTech公司，UM171、SR1购自MedChemExpress，流式细胞术检测抗体ANTI-HU CD34 4H11 APC，ANTI-HUCD133TMP4PE，Penicillin-Streptomycin购自美国Thermo scientific公司。15、50 mL离心管，35 mm低黏附培养皿购自Corning公司。

RoboSepTM-S细胞分选仪购自加拿大STEMCELL 公司，BD FACSAria III流式细胞分选仪购自美国Becton Dickinson公司。

1.3 方法

1.3.1CD34+造血干细胞分离和提取 根据EasySepTMHuman Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II试剂盒的说明书，将新鲜的脐带血样本进行梯度密度离心，吸取其白膜层细胞并用PBS清洗，将细胞与磁珠分选试剂盒正确放置于RoboSepTM-S 细胞分选仪，启动程序，完毕后即可收集CD34+造血干细胞。

1.3.2CD34+造血干细胞的培养 收集经磁珠分选后的CD34+造血干细胞，用StemSpanTMSFEM II培养基作为基础培养基，另外添加SCF (100 ng/ml)，TPO (100 ng/ml)，Flt3-ligand (100 ng/ml)，IL-6 (100 ng/ml)，1% Penicillin-Streptomycin，加或不加UM171(35 nm)、SR1(750 nm)进行悬浮培养。置于37 ℃，5%CO2培养箱。隔天离心(400 rcf，5min)换液，控制细胞密度。

1.3.3细胞流式细胞仪检测分选 将细胞过40 um孔径的细胞筛，300rcf，10 min离心收集，每1×108的细胞重悬于100 ulPBS中，分别加入5ul ANTI-HU CD34 APC，ANTI-HU CD133PE抗体，4 ℃避光30 min，后加1 mlPBS以清洗多余抗体，离心收集细胞，用适量PBS重悬细胞于流式管中。收集细胞的流式管加入2 mlPBS，湿润管壁。上流式细胞仪分选。按照CD133的荧光强度，可将细胞分为3群，即CD34+CD133high，CD34+CD133low，CD34+CD133neg。

1.3.4流式细胞仪分选后CD34+造血干细胞的分群培养 收集分选后的3群细胞，计算细胞量与活性，每群细胞取5×105的量，各自两两组合，即H+H组(CD34+CD133high+CD34+CD133high)，L+L组(CD34+CD133low+CD34+CD133low)，N+N组(CD34+CD133neg+CD34+CD133neg)，H+L组(CD34+CD133high+CD34+CD133low)，L+N组(CD34+CD133low+CD34+CD133neg)，H+N组(CD34+CD133high+CD34+CD133neg)，再加1×106的未经流式分选的D5 cell作为对照组，每一组细胞总量为1×106。继续用上述组3培养基，置于37℃，体积分数5%CO2培养箱悬浮培养。隔天离心(400 rcf，5min)换液，控制细胞密度，培养5天。

1.3.5分群扩增培养后的细胞检测 将培养10 d的细胞，于countstar 计数并统计存活率。染CD34 APC，CD133PE抗体，进行流式细胞检测。

1.3.6CFU集落形成能力检测 调整细胞密度1×105/ml，取100 μL细胞悬液加入含有1.0 mL MethoCultTMCellWashMedium 的离心管中；混匀，取100 μL细胞悬液加入含有1.1 mL Metho Cult 培养液的离心管中，涡旋震荡后，静置10 min以上，使气泡消散；用2.5 mL 注射器吸取细胞培养液，接种于35 mm低黏附培养皿，避免产生气泡。置于37 ℃，5%CO2培养箱，14 d后于显微镜下计数各系集落。

2 结果

2.1 正常扩增培养过程中CD34+CD133+阳性率

在扩增培养的D1，D4，D7，D10分别取1×106细胞，染CD34，CD133流式抗体，进行了流式细胞术检测(图1)。结果显示，随着培养天数递增，CD34+CD133+比例逐渐下降，细胞的干性仍逐渐下降。

2.2 小分子对CD34+CD133+细胞扩增的影响

本研究对UM171，SR1小分子的各自添加和联合使用对CD34+CD133+细胞扩增的影响进行分析，在培养的第5天对扩增的细胞统计数量(n=6)，对照组(5.86±2.036)×106，UM171组(7.22±2.415)×106，SR1组(10.31±1.234)×106，UM171+SR1组的细胞扩增的数量最多，为(14.05±2.049)×106。UM171+SR1组与其余组差别有统计学意义(P<0.05)。同样的，在体外扩增培养的第5天对对照组，UM171组，SR1组，UM171+SR1组扩增的细胞进行流式细胞术检测，在D5 的时候，细胞的CD34+CD133+比例为UM171+SR1组(66.13±4.603)%、UM171组(60.65±8.030)%、SR1组(60.57±5.253)%，均高于Control组(40.28±6.349)%(P<0.05)，但UM171+SR1组，UM171组，SR1组间差别无明显统计意义(P>0.05)。见图2-7。

图1 流式细胞术检测结果

2.3 小分子对扩增5天后细胞集落形成能力的检测

分别使用UM171，SR1和UM171+SR1扩增培养CD34+造血干细胞至第 5天。Control组为未添加UM171和SR1的造血干细胞培养基，在第5天时，分别取1000个细胞作造血干体外集落形成能力检测(n=3)，对照组CFU集落数目(39.67±2.082)，单独使用UM71(64.67±3.215)，单独使用SR1(51.33±6.506)，UM171+SR1组(88.00±4.000)，对照组，UM171组，SR1组和UM171+SR1组，4组间的差别有明显统计学意义(P<0.05)。集落形成的类别无明显差异。结合细胞扩增数目与流式检测数据，UM171+SR1组无论在扩增的细胞数量，干性的维持和体外集落形成能力上都比单独使用其中一种更为明显。见图2-7。

图2 对照组、UM171组、SR1组、UM171+SR1组在第5天时细胞数量统计图(n=6)

图3 在第5天时，对照组、UM171组、SR1组、UM171+SR1组CD34+CD133+流式图

2.4 不同的细胞分群培养对CD34+CD133+HSC后期扩增的影响

联合使用UM171+SR1小分子体外扩增培养5 d后的细胞，进行流式细胞富集分选，分选后收集的细胞群两两组合培养5 d，在总扩增培养的第10天，对各组的细胞进行细胞计数(n=3)，H+H组，即CD34+CD133high+CD34+CD133high细胞扩增数量为(38.44±0.456 1)×106，H+L组即CD34+CD133high+ CD34+CD133low的细胞扩增数量为(23.77±0.713 4)×106均高于剩余几组，差别有统计学意义(P<0.05)。剩余组别统计学分析，对照组扩增数量为(16.47±0.808 3)×106，H+N组(18.64±2.697)×106，L+L组(14.27±0.2686)×106，L+N组(14.00±0.445 4)×106，N+N组(14.33±1.114)×106，差别无明显统计学意义。CD34+CD133+比例流式结果统计表(4C)，H+H组(51.37±2.859)%，H+L组(43.90±4.104)%，H+N组(43.60±3.830)%，均明显高于其他几组，差别有统计学意义(P<0.05)。对照组(26.57±2.902)%，L+L组(10.49±1.662)%，L+N组(4.79±1.506)，N+N组(0.061±0.016)%。结合细胞扩增数量及CD34+CD133+比例流式结果分析，CD34+CD133high细胞群在促进细胞增殖速度及细胞干性维持中发挥重要作用。见图4-7。

图4 对照组、UM171组、SR1组、UM171+SR1组在第5天时CD34+CD133+双阳性率统计图(n=6)

图5 第5天，流式细胞群分选图

图6 第10天时，各实验组细胞数量增殖图(n=3)

图7 第10天时，各实验组CD34+CD133+双阳性率统计图(n=3)

3 讨论

造血干细胞在体外扩增培养中，会失去其干性并分化成各系血细胞，无论是临床治疗或是基础研究，都需要大量维持能干性的造血干细胞。添加细胞因子SCF 、TPO、Flt3-ligand 、IL-6可有效提高体外扩增培养的CD34+细胞的数量及活性[12]。近年来，越来越多的小分子被研发出来，如何挑选出合适的小分子化合物，且小分子之间的联合应用是否有效，需要我们去充分了解其靶向作用位点，安全性及毒性，并需要一定的时间和动物实验验证其能否用于临床治疗。SR1是AHR芳香烃受体拮抗剂嘌呤衍生物，UM171则通过了作用于转化生长因子 β 信号通路扩增造血干细胞[13]，能促进长期造血干细胞的增殖[14]。宋赫楠等人利用 SR1、 UM171 及二者联合，成功在体外扩增了脐带血来源的 CD34+造血干细胞并维持了其干性[15]。

实际上CD34+细胞并非单一细胞群，其异质性较为明显，通过对CD34+细胞单细胞测序，发现其中可细分为造血干细胞(HSC)，粒-巨噬祖细胞(GMP)，多能淋巴祖细胞(MLP)等10种[16]。Adam C. Drake等人通过大量实验验证，仅通过表面抗原CD34，CD133作为检测体外扩增培养后的细胞干性的流式抗体，将扩增后的细胞移植到NSG小鼠体内，能在小鼠骨髓内检测到人来源的各系血液细胞[17]。

孕12周到24周胎儿的主要造血场所为肝脏[18]，但是因来源及伦理限制，不能作为临床治疗造血干细胞的来源，目前其可作为来源进行实验室基础研究。Kylie Su Mei Yong[19]等人研究证明，CD34lowCD133low的肝脏细胞可以促进CD34highCD133high造血干细胞的增殖，扩增后的CD34highCD133high造血干细胞仍维持了在小鼠体内重建血液系统的能力并可实现二次移植。因此我们假设造血干细胞分群后进行组合培养可促进自身的CD34highCD133high造血干细胞的增殖。鉴于胎肝作为来源提取的CD34+造血干细胞因样本质量参差不齐，数量差异非常明显，但相对于脐带血来源的CD34+造血干细胞数量来说是都十分庞大；且流式细胞分选技术会损失一定量的细胞，新鲜脐带血经磁珠分选出的CD34+造血干细胞数量通常仅为106，所以我们尝试在体外常规扩增造血干细胞5天后，再利用流式细胞分选技术，分群继续扩增培养。

本实验在SCF，TPO，Flt3-ligand，IL-6的细胞因子基础上，再结合UM171、SR1两种小分子，结合流式细胞分选技术，实现了体外培养10天后，不仅细胞得到大量增殖，且保持近似50%的CD34+CD133+的双阳性率，通过分群培养的数据可得出，CD34+CD133high细胞群，对于造血干细胞的数量增殖和干性维持至关重要。可为将来UM171+SR1小分子及流式细胞技术的联合应用提供有效支持。该方案是否适用于造血干细胞临床产品的制备，需要我们进一步探索。