实验探究酱油的氨基酸总含量

王明瑞,侯彦喜

(1.开封大学,河南 开封 475000;2.开封市发酵食品工程技术研究中心,河南 开封 475000)

酱油是以大豆(脱脂大豆)、小麦(小麦粉、麦麸)为主要原料,经过微生物发酵制成的调味品。酱油是有特殊色、香、味的液体，含有300多种芳香成分，集鲜、咸、香、甜、微酸等味道于一体，是地地道道的中国味道。在餐桌上，使用酱油可以使饭菜提味、生鲜、增香、上色，同时还能补充人体不能合成的一些氨基酸。

尽管时代变迁，然而酱油依然是人民大众餐桌上最主要的调味品之一。酱油含有多种氨基酸、食盐、糖类、有机酸以及色素、香料等成分。酱油的鲜味主要来自谷氨酸和天冬氨酸。鸡肉、鱼肉、蘑菇、鸡蛋等食品的鲜味，来自其所含的丰富的氨基酸。食品的氨基酸含量可以用“氨基酸态氮”来表示。根据国家标准，酱油的氨基酸含量的测定方法有酸度计法和比色法。酸度计法是利用甲醛固定氨基酸中氨基,用碱液滴定羧基,以酸度计指示滴定终点的方法。因为使用仪器简单，操作方法简便，所以酸度计法已经被广泛采用。

本研究对市场上12种不同种类、不同品牌的酱油进行氨基酸态氮含量检测，以期进一步树立食品营养和安全的理念，为人们选择食用酱油提供科学参考。

1 实验部分

1.1 实验用品

仪器：磁力搅拌器、滴定台、100 mL容量瓶、100 mL量筒、200 mL烧杯、碱式滴定管、PHS-3C酸度计(上海仪电科学仪器有限公司)。

试剂：蒸馏水、邻苯二甲酸氢钾(缓冲溶液)、Na2HPO4+KH2PO4(缓冲溶液)、甲醛(36%溶液)、NaOH标准溶液(0.050 mol/L)。

试样：酱油样品(市售)。

1.2 酸度计校准及维护

打开酸度计，需要预热30 min。校准时，先将“选择”旋钮调到pH档，用“温度”旋钮调节对应溶液温度，将“斜率”旋钮调到100%位置。用去离子水多次冲洗复合电极，用滤纸把复合电极擦拭干净。将复合电极插入缓冲溶液中，测混合磷酸盐(pH=6．86，25 ℃)标准缓冲溶液pH值。此时，调节“定位”旋钮，使酸度计读数为6.86，直到稳定不变。然后，用复合电极测邻苯二甲酸氢钾(pH=4.00，25 ℃)标准缓冲溶液pH值，调节仪器“斜率”旋钮，使酸度计读数为4.00，直到稳定。校准完成后，“定位”旋钮、“斜率”旋钮不能再旋转调动。用蒸馏水清洗复合电极并用滤纸擦干，将复合电极浸没在待测样品溶液中，待酸度计读数稳定后，酸度计读数即待测溶液的pH值。

pH复合电极前端有一保护瓶。瓶内装有适量电极浸泡溶液，用来保护复合电极。当发现保护瓶中的浸泡保护液有混浊或者发霉现象时，应当及时清洗电极和保护瓶，并重新配制电极保护浸泡液。

1.3 实验原理

在酱油样品溶液中，首先加入NaOH溶液，调到pH=8.2，中和样品中原有的游离酸。然后，利用氨基酸的两性，加入36%甲醛溶液固定氨基酸中氨基的碱性，使氨基酸中羧基的酸性呈现出来。接着，用NaOH标准溶液滴定加入甲醛后的样品溶液，在pH=9.2时达到滴定终点。从开始滴定到pH=8.2停止，此阶段消耗的NaOH反映了酱油中酸性物质的量。加入甲醛溶液固定氨基后，加入碱液，pH值从8.2增加到9.2，此阶段消耗的NaOH对应的是酱油样品的氨基态氮含量。

加入甲醛后消耗的n(NaOH)=n(羧基)，根据氨基酸性质可知，n(N)=n(氨基)=n(羧基)=n(NaOH)。具体反应如图1所示。

图1 氨基酸态氮滴定基本原理

1.4 实验内容与步骤

1.4.1 样品处理，中和游离酸

精确吸取5.0 mL酱油样品于100 mL容量瓶中，加水稀释摇匀，定容到刻度线。在200 mL烧杯中，准确移取20.0 mL稀释溶液，再加入蒸馏水60 mL，用酸度计测量溶液的pH，打开磁力搅拌器搅拌溶液，用0.050 mol/L NaOH 标准溶液滴定样品溶液。当溶液的pH= 8.2时停止滴定，记录NaOH标准溶液滴定过程消耗的体积(mL)，可以计算出酱油样品中的酸性物质含量。

1.4.2 甲醛固定氨基，酸碱滴定测定羧基

向pH=8.2样品溶液中准确加入甲醛溶液10.0 mL，摇匀。用0.050 mol/L NaOH标准溶液继续滴定，注意观察溶液pH值变化。当酸度计指示烧杯中被滴定的溶液pH=9.2时停止滴定，记录此阶段消耗NaOH标准溶液的体积V1(mL)。

1.4.3 试剂空白试验

在另一个200 mL洁净烧杯中，加入80 mL蒸馏水，滴加0.050 mol/L的NaOH标准溶液数滴，将溶液的pH值调整为8.2。再加入10.0 mL甲醛溶液，用0.050 mol/L NaOH标准溶液滴定。当被滴定的溶液pH=9.2时停止滴定，记录滴入甲醛后NaOH标准溶液消耗的体积V2(mL)。

1.4.4 实验数据处理

酱油样品中氨基酸态的氮含量计算公式为：

X——酱油样品中氨基酸态氮的含量(g/100 mL)；V1——试样加入甲醛后消耗NaOH标准滴定溶液的体积(mL)；V2——蒸馏水加入甲醛后消耗NaOH标准滴定溶液的体积(mL)；0.050——c(NaOH)=0.050 mol/L；0.014——NaOH标准滴定溶液1 mmol对应的氮元素的质量(g)；5.00——吸取试样的体积(mL)；20.0——试样稀释液的取用量(mL)；100.0——酱油样品稀释定容到100.0 mL；100——100 mL酱油样品。

2 测定结果

根据酸度计法对市场上12种酱油中的氨基酸含量进行测定，酱油的品牌、规格、等级及测定结果如表1所示。

表1 酱油样品氨基酸态氮测定结果

表1数据表明，实验中酱油样品的氨基酸态氮含量均达到国家规定的标准，标签标注含量合格。同时，酱油分级中表示氨基酸态氮含量高低的营养等级，与生产工艺中的卫生等级概念不同，例如在三级酱油中也有卫生等级高、可以用于佐餐凉拌类的酱油。

3 实验注意事项及小结

3.1 空白试验及其他影响条件

在滴定过程中，蒸馏水和甲醛溶液也会消耗少量的NaOH溶液，所以要在不加酱油样品、其他条件均保持不变的情况下进行测定消耗NaOH的空白试验。在计算样品溶液中的氨基酸态氮时需要扣除试剂空白。研究表明，对于不同批的蒸馏水、不同瓶的甲醛而言，空白试验的数据是不同的。如果空白试验结果不准确，检测结果就会有误差，有可能将不合格的产品误判为合格。

如果样品含有铵盐，那么加入甲醛，铵根也会被强化，释放出氢离子。用NaOH滴定时，同样会消耗碱液，导致样品中氨基酸态氮测定结果偏高，因此试样中要避免铵盐的引入。

3.2 酸度计指示滴定终点

对于无色的酒类、醋类食品样品，可以用双指示剂(中性红：6.8～8.0由红色变为琥珀色；百里酚酞：9.4～10.6由无色变为蓝色)指示滴定终点。因为酱油本身的颜色较深，所以用酸碱指示剂通过溶液颜色变化指示终点有困难，有些实验在活性炭脱色后再测定，误差较大。选用pH计指示滴定终点，测定可以不受样品溶液体系混浊和色深因素影响。此方法可以快速测定滴定结果，已经被国家标准制定者采用。

3.3 氨基酸态氮测定应用

在醋、酵素等发酵类食品和各种酒水中，均存在蛋白质水解产生的游离氨基酸。氨基酸含量也是衡量保健食品及酒类饮料的重要质量指标。使用甲醛固定氨基、酸碱滴定测定羧基的方法可以测定食品类样品中的游离的氨基酸含量。可以利用此方法进行食品品质检验和质量控制。例如，氨基酸态氮含量是发酵食品发酵程度的特性指标，可以根据氨基酸态氮含量调整、控制生产工艺参数，优化生产工艺。

另外，现在已经有利用氨基酸来清除生活环境中的甲醛等有毒气体的应用案例。

4 实验探究启示

根据不同生产工艺流程，酱油曾经被分为酿造和配制两大类。酿造酱油利用微生物发酵、酿制而成；配制酱油是以酿造酱油为基础，添加蛋白调味液、其他食品类助剂后进一步配制后形成。配制酱油容易被掺假，因此配制酱油逐渐退出人民的生活。最新的国家标准《食品安全国家标准 酱油》已经于2019年12月份实施，规定只有采用传统酿造工艺生产出来的才是“酱油”，从此以后调配的“酱油”只能称作“复合调味料”。

根据烹饪需要，酱油可分为老抽和生抽。生抽咸香，可以提鲜；老抽味淡色重，可以上色。酱油外包装的标签上会标注“佐餐酱油”或“烹饪酱油”。佐餐酱油的卫生程度高,可以直接生吃；烹调酱油卫生指标低，需要在烹调过程中进一步消毒杀菌。用佐餐酱油烹调菜肴是可行的，而烹调酱油直接入口则有一定的安全隐患。生抽提鲜，老抽上色，佐餐酱油凉拌，用途各不相同。从安全卫生角度来说，居家烹饪时最好备齐烹调生抽、烹调老抽和佐餐酱油。

在现实生活中，人们对酱油选用还存在一些误区：一是酱油颜色越深越好；二是酱油味道越鲜越好；三是酱油价格高就是品级高；四是所有酱油都可以用来炒菜或凉拌；五是调味汁、酱汁也属于酱油；六是不能吃盐的人可以使用酱油调味。这些误区不但降低人们的生活质量，而且存在安全隐患。例如，现阶段市场上已有儿童专用的酱油，在选择儿童酱油时，一定要关注酱油的食盐含量。只有进行科学普及，使更多的人熟悉化学知识，才能减少错误和偏见。