CRISPR/AsCpf1 双切刻系统构建初探

辛京京，李和刚，秦怀远，张 宁，赵金山

（青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109）

CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short palindromic Repeats）是在生命进化的历程中产生的，它是细菌和病毒长期竞争的产物。病毒以细菌为载体，把自己的基因导入到细菌当中，通过细菌复制达到病毒基因复制的目的；细菌为了消除自身染色体上的病毒基因[1-3]，进化出独特的CRISPR 系统。CRISPR 系统克服了传统基因编辑打靶效率低、实验周期长及应用范围窄等缺点，凭借高效、操作简单等优势在生物学领域获得广泛应用[4-7]，这种简单的RNA 导向基因编辑技术已成为生物学中的革命性工具。

Zetsche 等[8]研究发现了一种使CRISPR 技术更简单、更准确的方法，即CRISPR/Cpf1 系统。Cpf1 是由一条crRNA 引导的v 型Cas 内切核酸酶，它相对于Cas9 具有多方面的优势，包括分子量大小、剪切方式、剪切位置等。Cpf1 拥有广阔前景，但仍有一些亟需解决的技术问题，比如依然存在脱靶效应[9]，因此可以考虑将Cpf1 蛋白改造成Double nickase（双切刻酶），以进一步降低脱靶效应。

Ran 等[10]将Cas9 切刻酶突变体与配对的向导RNA 组合以引入靶向的双链断裂，实验证明使用成对的单链切口可以将细胞系中的脱靶活性降低50～1 000倍。与此类似，Takashi 等[11]研究发现，R1226A（精氨酸突变为丙氨酸）突变体产生切刻酶，切割非靶DNA 链而不是靶链（即只切割单链）。另外，由于野生型Cpf1 识别的PAM 为TTTV，此类识别位点比较稀少，如果简单通过R1226A 的突变来组合双切刻系统，要找到合适的基因编辑靶位点不太容易；针对这一问题，可以考虑在Cpf1 RR 突变体（识别PAM 为TYCV）[12]基础上进行改造，适当拓展双切刻系统的靶标范围。本研究以AsCpf1 RR 突变体为基础进行了一些定点突变的改造，通过细胞转染后进行双荧光素酶报告基因检测的方式评价这些突变体的DNA 靶向切割能力。

1 材料与方法

1.1 实验材料 迪庆绵羊皮肤成纤维样细胞（DQSHS1）购自中国科学院昆明动物研究所，目录号：KCB90012S；pY010 质粒购自Addgene 公司，货号：69982；SSA-DKK2 报告载体由本实验室保存；BbsI 限制性内切酶购自NEB 公司，货号：R3539S；DH5α感受态细胞购自TaKaRa 公司，货号：AIG1025A；T4 DNA 连接酶购自天根生物公司，货号：B0202S；DNA胶回收试剂盒购自天根生物公司，货号：DP209-02；去内毒素质粒提取试剂盒购自OMEGA 公司，货号：D6948-01；Lipo3000 脂质体购自美国Invitrogen 公司，货号：L3 000015；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京原平皓生物科技有限公司，货号：LF103-01；DNA 寡核苷酸由青岛擎科生物技术有限公司合成。

1.2 载体构建

1.2.1 crRNA 通用表达骨架载体pCpf1-crRNA 的设计与构建 设计与AsCpf1 匹配的crRNA 的通用表达骨架载体pCpf1-crRNA（图1）。

图1 通用表达载体质粒图

crRNA 通用表达载体各元件序列如下：

U6 启动子序列：

转录起始信号为G，crRNA 上游序列：TAATTTCT ACTCTTGTAGAT，spacer 克隆位点为GGGTCTTCG AGAAGACCTGC，U6 终止子：TTTTTT。

合成上述序列，插入到pUC57 载体的EcoRV 酶切位点，获得pCpf1-crRNA 载体。此过程委托青岛擎科生物技术有限公司完成。

1.2.2 靶向crRNA 表达载体的设计与构建 根据绵羊DKK2基因的部分基因组DNA 序列（NC_040257.1，21620923...21621362，440 bp）设计AsCpf1 的crRNA靶标，合成相应的DNA 寡核苷酸，其序列信息如表1。

按照表1 所示，与各自crRNA 靶标相对应的寡核苷酸两两退火，反应条件：95℃ 5 min，72℃ 10 min，置冰上，获得14 条双链DNA 寡核苷酸，依次为T1、T2、T3、RRF1、RRF2、RRF3、RRF4、RRF6、RRF9、RRF10、RRR1、RRR3、RRR5、RRR7。

使用Bbs Ⅰ内切酶切割Cpf1-crRNA 载体。将所得14 条双链DNA 寡核苷酸分别与切割并纯化后的Cpf1-crRNA 载体连接；连接产物进行感受态细胞（DH5α）转化；涂板，将培养板37℃过夜倒置培养。

挑取单菌落加入到含有1 mL LB（含50 mg/mL 氨苄青霉素）的1.5 mL 离心管中，200 r/min 摇菌7～8 h，进行PCR 检测，使用与各自靶标相对应的正义链寡核苷酸分别与反向引物X2crRNA-R 配对，检测相应单菌落，将获得120 bp 条带的阳性菌落送往青岛擎科生物技术有限公司测序验证（测序引物为X2crRNA-R）。

1.3 构建突变体 突变体构建方案如表2 所示，委托青岛擎科生物技术有限公司在pY010 质粒基础上完成一系列突变实验。

1.4 瞬时转染 选取生长状态良好并且传代代数在3～5代的迪庆绵羊成纤维细胞进行消化传代到24 孔板进行培养，当细胞丰富度达到80%～90%时进行细胞转染。本次转染实验共设计4 组，均以Cpf1-crRNA 载体作为对照组，其中第一批次实验是将Cpf1-T1、Cpf1-T2、Cpf1-T3（使用量均为0.5 μg）分别单独与pY010 质粒以及SSADKK2 筛选载体进行共转染，目的是验证本实验设计的Cpf1-crRNA 靶标是否有效；第二批次实验首先将Cpf1-T1、Cpf1-T2、Cpf1-T3 分别与Cpf1-R1226A 质粒以及SSA-DKK2 筛选载体共转染，验证野生型的Cpf1发生R1226A 的单点突变后，单个AsCpf1 切口酶的切割活性；然后再将两对靶标组合（Cpf1-T1+Cpf1-T3、Cpf1-T2+Cpf1-T3）分别与Cpf1-R1226A 质粒以及SSADKK2 筛选载体共转染，进一步验证成对的AsCpf1 切口酶对于双链的切割能力；第三批次实验是将RRF6、RRF9、RRR5 3 个靶标分别与Cpf1-RRA 质粒以及SSADKK2 筛选载体共转染，验证RRA 突变型的Cpf1 能否特异性识别并切割TYCV PAM 靶标；第四批次实验是将Cpf1-RRA 突变体进行R1226A 单点突变，将设计的7 对靶标组合（RRF1+RRR1、RRF2+RRR3、RRF3+RRR3、RRF4+RRR5、RRF6+RRR7、RRF9+RRR7、RRF10+RRR7）分别与Cpf1-RRAA 质粒以及SSA-DKK2 筛选载体共转染，验证RRA 突变型的Cpf1 进一步发生R1226A 的单点突变后，对双链切割的能力。转染后，孵育细胞48 h 后测定双荧光素酶活性。每一批次实验均重复3 次。转染后将数据分析结果记录于Excel 表格中，使用t 检验对各组结果差异显著性进行处理（将实验组与对照组进行比较，实验组之间不做对比）。

表1 DNA 寡核苷酸序列

表2 突变体构建

1.5 双荧光素酶报告基因检测

1.5.1 细胞裂解 首先进行细胞洗涤，用移液枪将细胞培养板中的培养基去除，并通过PBS 对细胞进行冲洗，冲洗次数3 次，尽量去除洗涤液。之后，根据所用细胞培养板的大小按量加入配置好的细胞裂解液（CLB），用移液枪充分吹打混匀，使细胞得到充分裂解，裂解时间以不超过30 min 为宜。

1.5.2 萤火虫荧光素酶活性测定 取100 μL LAR（Luciferase Assay Reagent，荧光素酶分析试剂）加入Promega GloMax 20/20 发光检测仪测定管底部，加入20 μL 待测样品，轻轻混匀后，放入仪器中进行检验。

1.5.3 海肾荧光素酶活性测定 当1.5.2 的样品表达量检测出来之后，向样品中加入与LAR 等量的SR（Stop Reagen，终止试剂），轻轻混匀后，放入仪器进行检测，Stop Reagent 可以立即终止萤火虫荧光素酶发光，并且同时启动海肾荧光素酶发光反应，加入体系与1.5.2 相同。记录海肾荧光素酶反应强度（RLU2）与萤火虫荧光素酶反应强度（RLU1）的数值，计算两组数据的比值，即RLU2/RLU1（简写为R2/R1）。

2 结果与分析

2.1 引物退火 当成对寡核苷酸经过退火程序结合形成双链DNA 序列后，在琼脂糖凝胶电泳中显示目的条带单一且明亮，可进行下一步实验（图2）。

图2 靶标退火结果

2.2 酶切 使用BbsI 限制性内切酶酶切质粒，将环形质粒切割成链状基因序列，从而与质粒在凝胶电泳中产生距离差（图3），本实验酶切效果良好，质粒被成功切开。

图3 酶切结果

2.3 菌液PCR 结果 菌液PCR 及琼脂糖凝胶电泳鉴定结果如图4 所示，在挑选的15 个单菌落中，T1-1（1）、T1-2（2）、T1-3（3）、T1-4（4）、T2-1（6）、T2-2（7）、T2-3（8）、T2-4（9）、T2-5（10）、T3-2（12）、T3-3（13）、T3-4（14）、T3-5（15）的PCR 结果条带单一明亮，但T1-5（5）、T3-1（11）看不到条带，因此挑选2、3、8、9、13、14 进行质粒提取并送往公司进行测序。

图4 菌液PCR 鉴定结果

2.4 打靶载体和突变体构建测序结果 测序结果表明（图5-A），T1-2（2）、T2-3（8）、T3-4（14）目的序列正确的连接到载体上，获得Cpf1-T1、Cpf1-T2、Cpf-T3 载体。其他靶标crRNA 表达载体PCR 结果类似，本文略去。由图5-B 可知，4 个定点突变均设计成功。

图5 打靶载体和突变体构建的测序结果

2.5 双荧光素酶报告载体检测法检测结果 通过双荧光素酶报告载体检测法检测转染结果，计算出海肾荧光素酶与萤火虫荧光素酶的比值。每一批次转染实验均重复3 次，结果均具有较好的可重复性，故选取其中一次转染实验的结果作为代表进行作图展示（图6）。

图6 转染效果图

将Cpf1-T1、Cpf1-T2、Cpf1-T3 分别单独与pY010质粒以及SSA-DKK2 筛选载体进行共转染的结果可以验证本实验设计的Cpf1-crRNA 靶标是有效的（图7-A）。Cpf1-T1、Cpf1-T2、Cpf1-T3 分别与Cpf1-R1226A 质粒以及SSA-DKK2 筛选载体共转染结果表明（图7-B），野生型的Cpf1 发生R1226A 的单点突变后，单个AsCpf1切口酶在3 个TTTV PAM 靶位点中的2 个靶位点具有显著的切割活性，说明其切割DNA 双链的能力并没有完全丧失；2 对靶标组合（Cpf1-T1+Cpf1-T3、Cpf1-T2+Cpf1-T3）分别与Cpf1-R1226A 质粒以及SSA-DKK2 筛选载体共转染结果表明（图7-C），2 条靶位点相距100 bp以上的crRNA 可以诱导AsCpf1 切口酶造成实质上的双链断裂；RRF6、RRF9、RRR5 3 个靶标分别与Cpf1-RRA 质粒以及SSA-DKK2 筛选载体共转染结果表明（图7-D），RRA 突变型的Cpf1 可以特异性识别并切割TYCV PAM 靶标；Cpf1-RRA 突变体进行R1226A单点突变之后，将设计的7 对靶标组合（RRF1+RRR1、RRF2+RRR3、RRF3+RRR3、RRF4+RRR5、RRF6+RRR7、RRF9+RRR7、RRF10+RRR7） 分别与Cpf1-RRAA 质粒以及SSA-DKK2 筛选载体共转染，结果表明（图7-E），RRA 突变型的Cpf1 进一步发生R1226A 的单点突变后，不仅丧失了切割双链的功能，连预计的单链切刻的活性都没有了，但是仍有可能具有识别并结合特定靶标的能力。

图7 双荧光素酶报告载体检测法检测结果

3 讨 论

Gao 等[12]使用基于结构导向的靶向诱变技术设计出2 种AsCpf1 和LbCpf1 突变体RVR (S542R/K548V N552R)和RR(S542R/K607R)，它们分别可以有效识别5'-TATV-3'PAM 序列和5'-TYCV-3'PAM 序列，增加了Cpf1 的靶向范围。研究证明，设计FnCpf1 和MbCpf1的RR 突变体并将它们与AsCpf1 和LbCpf1 突变体进行比较，最终能够在保留对TTTV PAM 靶标活性的基础上，特异性地识别TYCV PAM 靶标，同样扩展了靶标范围[13]；Kleinstiver[14]等通过人类细胞实验表明，与大多数Cpf1 直向同源物相比，enAsCpf1 变体靶向范围大约提高了7 倍，同时还具有优异的靶向活性。本实验结果表明，RRA 突变型的AsCpf1 可以特异性识别并切割TYCV PAM 靶标，扩展了靶标范围，与之前的文献报道相符[12]。

研究证明，成对的切口能够在细胞系中将脱靶活性降低50～1 000 倍，并促进小鼠受精卵中的基因敲除而不影响靶向切割效率[10]；当距离相近的一对sgRNA同时识别并结合目的基因的特定区域后，Cas9n 酶通过2 个相邻的单链切口实现DNA 双链的断裂[15]；本研究将野生型的Cpf1 进行“改造”（R1226A 的单点突变）后，其切割DNA 双链的能力并没有完全丧失，它是否能对染色体上内源性基因靶位点展开有效的DNA双链切割还有待验证；虽然2 个靶位点相距100 bp 以上的crRNA 可以诱导AsCpf1 切口酶造成实质上的双链断裂，但是成对的crRNA 能否起到有效的协同作用还需要通过内源性基因敲除效率检测实验来进一步证实。就目前结果来看，成对的AsCpf1 切口酶造成的双链DNA 切割效率较低，尤其是当它发生RRA 突变之后，甚至不能产生DNA 单链切口。因此可以考虑将LbCpf1 或者其他直系同源物用来进行双切刻系统的研究与改良。有研究证明，HkCpf1 可以识别更为宽泛的PAM 序列（5'-YTN 和5'-TYYN），进一步提高基因组靶标的识别范围[16]，理论上更适合用来做双切刻系统。Kleinstiver 等[14]构建了enCpf1、enRR 等突变体，尤其是enCpf1 突变体将Cpf1-BE3 的碱基编辑效率由接近于0 提高到2%～34%，由此推测en 突变（E174R/S542R/K548R）有可能恢复AsCpf1 RR 突变体的单链切刻活性。

本实验筛选阳性单克隆使用的方法是菌落PCR，以单个菌落作为模板可以快速鉴定菌落是否为含有目的基因的阳性菌落，操作简便，灵敏度高，是有别于酶切验证的高效方法；缺点是成本相对较高，需额外构建报告载体。本实验中报告载体SSA-DKK2 利用率较高，应用效果稳定，凸显出本方法在初步验证基因编辑工具有效性实验中的特殊优势。另外，目前某些向导RNA表达载体的构建指南推荐使用单菌落直接测序的方式来鉴定阳性克隆[17]，其主要逻辑是认为载体连接的效率很高，简单挑取几个单菌落就可以鉴定到阳性菌落。但是通过本实验室长期实践表明，在某些特定条件下，单菌落的阳性率并不高，甚至达不到10%。如果仅仅依靠测序来筛选，测序费用会比较高，而且影响实验进度；而使用PCR 检测的方式就可以进行较大范围筛选[18]，减少测序费用，加快实验进度。

本实验的另一个优点是使用双荧光素酶报告系统对转染结果进行检测，检测方便、快速，灵敏度高[19]，不受细胞内其他物质的影响。不同的crRNA 靶标切割效率差异较大，在难以转染的细胞系中通过T7E1 和Surveyor 核酸酶测定等方法鉴定高效靶标，比较耗费时间和精力。此外，对于T7E1 测定或Surveyor 核酸酶测定中的PCR 扩增，由于缺乏合适的引物对，有时难以特异性扩增基因组DNA 中的目的序列，对于基因组中具有高多态性的生物，还可能出现假阳性的结果[20]；相反，双荧光素酶报告基因测定不依赖于基因组扩增程序。

4 结 论

本研究证明，针对TTTV PAM 的CRISPR/AsCpf1双切刻系统有DNA 双链切割活性，但是单个的AsCpf1切口酶的DNA 双链切割活性并未完全丧失；AsCpf1-RRA 突变体针对TYCV PAM 靶标具有一定的DNA 双链切割活性；AsCpf1-RRAA 突变体没有检测到针对TYCV PAM 靶标的DNA 双链和单链切割活性，但可能保留了DNA 结合能力。