中药复合多糖对断奶仔猪肠道形态结构的调节作用

陈丽玲 ，邹田德，贺 琴，郭晓波，卢亚飞，罗波文，王自蕊*，游金明*

（1.江西农业大学动物科技学院，江西省动物营养重点实验室，江西省优质安全畜禽生产产教融合重点创新中心，江西南昌 330045；2.江西中医药大学实验动物科技中心，江西南昌 330004）

肠道既是营养物质消化吸收的主要场所，也是防御肠道病原菌等有害物质入侵的重要屏障。肠道绒毛结构异常和屏障功能损伤是导致断奶仔猪腹泻的关键内在因素[1]。因此，维持仔猪肠道形态和正常的屏障功能是促进仔猪健康生长的基本保证。仔猪早期断奶会导致小肠绒毛变短、隐窝加深、绒毛高度与隐窝深度之比（V/C）下降，从而降低饲料养分的消化利用率。未消化的养分在肠道堆积后将使肠道内渗透压增加，引发腹泻。同时，后肠段中有害菌和腐败菌增殖剧增，进一步加剧肠绒毛结构与功能的损伤[2]。仔猪小肠上皮细胞间良好的紧密连接结构是离子和氨基酸类营养物质选择性通过小肠黏膜的前提。仔猪断奶将下调肠上皮细胞间紧密连接蛋白的表达量，导致上皮细胞间紧密连接结构受损，进而提高肠道通透性、增加有害微生态入侵的几率。Ala-Gln[3]、丁酸梭菌[4]、啤酒酵母提取物[5]、酵母壁多糖[6]等功能性添加剂可以有效改善肠道形态结构、提高肠道屏障功能。而在目前饲料中全面禁止使用抗生素的背景下，以中草药作为替抗产品来改善仔猪肠道健康的研究逐渐成为热点。临床医学上证实，由白术茯苓（1:1）配比的中药复方可以治疗人的腹泻型肠道疾病，但在仔猪上鲜有报道。本研究小组在前期试验中发现，断奶仔猪饲粮中添加0.02%、0.04%、0.06%的白术茯苓多糖复方能显著提高仔猪的平均日增重，并降低断奶仔猪的耗料增重比，0.06%白术茯苓多糖还可有效降低仔猪的腹泻频率。基于此，本研究旨在进一步探讨白术茯苓多糖复方对仔猪肠道形态及肠上皮细胞紧密连接结构的调节作用，以掌握白术茯苓多糖复方促进仔猪生长、改善肠道健康的作用机制，为指导白术茯苓多糖复方在仔猪饲料中的科学应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 白术多糖（AtractylodesMacrocephalaon Polysaccharide，AMP）和茯苓多糖（Poriacocos polys accharide，PCP）由四川恒瑞通达生物科技有限公司提供，多糖含量均为37.5%，剩余部分为糊精。白术多糖和茯苓多糖在使用前按照1:1 预先混合后待用。

1.2 试验设计 选取150 头遗传背景一致、健康状况良好、体重（7.14±0.22）kg 的23 日龄杜×长×大断奶仔猪，按照完全随机设计方法分为6 组，每组5 个重复，每个重复5 头猪。空白组饲喂基础日粮，抗生素组在基础日粮中添加硫酸粘杆菌素20 mg/kg+杆菌肽40 mg/kg+喹乙醇100 mg/kg，4 个试验组分别在基础日粮中添加0.02%、0.04%、0.06% 和0.08% 白术茯苓多糖复方。基础饲粮是参考NRC（2012）和我国《猪饲养标准》（2004）配制成的玉米-豆粕型日粮（表1）。试验于2016 年11—12 月在江西省某牧业有限公司养猪场进行，试验期27 d。仔猪饲养于装有高床、漏缝地板、乳头式饮水器的保育舍，舍内温度控制为23～25℃、相对湿度为65%～75%。试验开始前对猪舍彻底清理、清洗、消毒。试验过程中，每日饲喂4～5 次。所有仔猪自由采食和饮水，其他饲养管理措施、免疫处理按猪场常规管理程序进行。

1.3 样品采集及处理 试验结束当天，从每个重复中随机选取1 头体重接近平均体重的仔猪，前腔静脉采集血10 mL 于真空抗凝采血管中。3 000 r/min 离心10 min，分装后置于-20℃保存备用。

1.3.1 肠段样品采集 试验结束时，从每个重复中随机选取1 头仔猪，肌注 4%戊巴比妥钠溶液进行麻醉。待麻醉完全后，颈静脉放血处死，沿腹中线剖开腹腔，剪取十二指肠、空肠、回肠中段各3～5 cm。用生理盐水小心冲洗肠道内食糜，而后用干净滤纸轻轻吸干肠道表面水分。将肠道一端结扎后，置于4%甲醛溶液中固定24 h 以上，用于制作石蜡切片。

1.3.2 肠道黏膜样品采集 用无菌手术剪剪取空肠和回肠中段各约6 cm。用镊子轻轻挤出肠道内容物，并将冷DEPC 处理水灌入肠腔，小心冲洗肠内容物。沿肠段纵轴剪开肠壁，经干净滤纸吸水后，用载玻片小心刮取小肠黏膜，分装于2 mL 无菌冻存管中，编号后立即放入液氮中速冻，最后转入-80℃保存，待后续提取总RNA 和总蛋白。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 肠道通透性 血浆D-乳酸（D-Lactace）、二胺氧化酶（DAO）含量使用全波长多功能酶标仪（Thermo，Massachusetts，America）测定，具体操作按照血浆D-Lactace ELISA 试剂盒（K667-100，美国BioVision）和DAO ELISA 试剂盒（SBJ-Z051，南京森贝伽生物科技有限公司）说明书执行。

表1 基础饲粮组成及营养成分（风干基础）

1.4.2 肠道形态结构 取出4% 甲醛溶液固定的肠道组织，经常规脱水、石蜡包埋、切片、H.E.染色后，利用Motic Images Advanced 3.2 软件，测量肠道隐窝深度和绒毛高度，每张切片观察10 个视野。计算绒毛高度/隐窝深度（V/C）。

1.4.3 小肠上皮细胞紧密连接蛋白及相关基因CDKN1A和p53 表达水平 根据GenBank 提供的猪基因序列，用PrimerExpress 5.0 软件设计ZO-1、Occludin、Claudin-1、CDKN1A及p53的基因特异性扩增引物。引物序列见表2，引物由上海生物工程有限公司合成。参考肖定福[7]方法提取空肠黏膜总RNA。以GAPDH为内参（F：5'-GAAGGTCGGAGTGAACGGAT-3'、R：5'-CATGGGTAGAATCATACTGGAACA-3'），按照PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser 反转录试剂盒说明进行反转录反应。以反转录产物为模板使用定量PCR（CFX96，美国伯乐）进行基因扩增，以测定空肠黏膜紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA以及CDKN1A和p53的相对表达量。另取空肠黏膜样，用裂解液裂解，采用BCA 法测定总蛋白浓度并将蛋白浓度调至一致。经过PAGE 分离后，将蛋白转移至PVDF 膜上，室温下用5% 脱脂奶粉封闭1 h，分别用兔抗Actin（ab8226，Abcam）、兔抗ZO-1（BS-1239R，北京博奥森生物技术有限公司）、Occludin（BS-10011R，北京博奥森生物技术有限公司）、Claudin-1（BS-13739R，北京博奥森生物技术有限公司）抗体和HRP 标记的羊抗兔抗体（ab6789，Abcam）孵育，以通过Western blot 法检测空肠黏膜ZO-1、Occludin 和Claudin-1 蛋白的表达量。

1.5 统计分析 所有数据用Excel2013 简单处理后，采用SPSS17.0 软件中单因素方差分析（One-Way ANOVA）模型进行方差分析，Duncan'S 法多重比较，各组数据以平均值±标准误表示。以P＜0.05 为显著性判断标准。

表2 实时荧光定量PCR 引物序列

2 结果与分析

2.1 白术茯苓多糖复方对断奶仔猪小肠绒毛形态结构的影响 如表3 所示，与抗生素组和空白组相比，饲粮中添加白术茯苓多糖复方能显著增加十二指肠、空肠和回肠绒毛高度，尤其是0.06%组增加最显著；各组间十二指肠隐窝深度差异不显著；抗生素组和0.04%、0.06%白术茯苓多糖复方组的空肠隐窝深度显著低于空白组；0.06%白术茯苓多糖复方组仔猪十二指肠的V/C 值显著高于0.02%、0.04%、0.08%白术茯苓多糖及抗生素组，但0.08% 白术茯苓多糖复方组仔猪的空肠、回肠V/C显著低于抗生素组；0.02%、0.04%、0.06% 白术茯苓多糖组仔猪十二指肠、空肠、回肠V/C 显著高于空白组，且随饲料中白术茯苓多糖添加量增加，V/C 呈逐渐升高趋势，但添加量达到0.08%时，十二指肠、空肠、回肠V/C 回落至与空白组无显著差异的水平。

2.2 白术茯苓多糖复方对断奶仔猪肠道通透性的影响由表4 可知，与抗生素组和空白组相比，饲粮添加0.02%、0.04%、0.06%、0.08% 白术茯苓多糖复方能显著降低血浆D-Lactate 和DAO 含量，且随着白术茯苓多糖复方添加量的增加呈先降低后回升的趋势（P＜0.05）。

2.3 白术茯苓多糖复方对断奶仔猪空肠黏膜紧密连接蛋白基因表达量的影响 如图1 所示，与抗生素组和空白组相比，饲粮中添加0.04%、0.06%和0.08%白术茯苓多糖复方能显著增加仔猪空肠黏膜ZO-1和Claudin-1mRNA 的相对表达量；0.04%和0.06%白术茯苓多糖复方能显著增加仔猪空肠黏膜OccludinmRNA 的相对表达量。随着白术茯苓多糖添加量的增加，ZO-1、OccludinmRNA 的相对表达量呈复方先增加后降低的趋势。

如图2 所示，饲粮中添加白术茯苓多糖复方对空肠黏膜ZO-1、Claudin-1 蛋白表达没有显著影响；Occludin 蛋白相对表达量趋势更为明显，当白术茯苓多糖复方添加量达0.06% 和0.08% 时，Occludin 蛋白相对表达量显著低于抗生素组，0.08%白术茯苓多糖复方组的Occludin 蛋白相对表达量显著低于空白组。

2.4 白术茯苓多糖对断奶仔猪空肠黏膜CDKN1A和p53mRNA 表达量的影响 由图3 可知，与抗生素组、空白组相比，饲粮中添加0.04%、0.06%、0.08% 白术茯苓多糖复方能显著提高仔猪空肠黏膜CDKN1AmRNA的相对表达量；各组间仔猪空肠黏膜p53mRNA 相对表达量则差异不显著。

表3 白术茯苓多糖复方对断奶仔猪小肠绒毛形态结构的影响

表4 白术茯苓多糖复方对断奶仔猪肠道通透性的影响

图1 白术茯苓多糖复方对仔猪空肠黏膜紧密连接蛋白mRNA表达量的影响

图2 白术茯苓多糖复方对仔猪空肠黏膜紧密连接蛋白的影响

3 讨 论

图3 白术茯苓多糖复方对仔猪空肠黏膜CDKN1A 和p53 mRNA 表达量的影响

研究表明，白术和茯苓多糖对调节动物的肠道形态结构有积极作用，如参苓白术多糖可缓解雨蛙素诱导的急性胰腺炎大鼠的小肠黏膜绒毛的损伤程度[8]，使大肠杆菌引起的腹泻小鼠十二指肠绒毛形态恢复正常[9]，还能治疗小鼠的脾虚泄泻，使小鼠肠上皮绒毛结构完整、脱落较少，且肠黏膜固有层、间质无明显水肿[10]。本试验结果表明，饲粮添加白术茯苓多糖复方能显著增加仔猪小肠绒毛高度，提高V/C；但添加量达0.08%时，十二指肠、空肠、回肠V/C 回落至与空白组无显著差异的水平。

肠道屏障结构的完整是肠道正常发挥吸收功能的重要基础之一。当肠道屏障受损时，肠道的通透性增大[3,11]。临床上常用参苓白术散来治疗功能性腹泻，药方中人参、白术、茯苓三者为君药，功能是补益脾气、渗湿止泻，且白术和茯苓比例是1:1。采用参苓白术散辅助治疗患者的血清DAO 低于西药常规治疗者[9]。参苓白术散（药方中人参、茯苓、白术为主，且白术茯苓比例为1:1）中、高剂量组使脾虚泄泻幼鼠血浆D-Lactate 和DAO 水平显著降低，说明中、高剂量参苓白术散可降低肠黏膜的通透性，保护肠黏膜屏障[12]。在养猪生产中，断奶应激常常造成仔猪肠道黏膜屏障损伤，进而增加肠道的通透性。本研究结果发现，断奶仔猪饲粮中添加白术茯苓多糖能显著降低血浆D-Lactate 和DAO 活性，且随着白术茯苓多糖添加量的增加呈先降低后有所回升的趋势。仇瑞莉等[9]和黄玉珍[12]的研究也表明，适量的白术茯苓多糖复方能缓解断奶应激对仔猪肠道黏膜的损伤，降低肠黏膜的通透性。但本研究结果显示，白术茯苓多糖添加量过大可能会对肠黏膜通透性产生不利影响。

肠上皮细胞间的紧密连接结构与肠道物理屏障功能与有密切相关性，保证肠道有效的紧密连接对维持肠上皮细胞极性和防止上皮细胞间隙中的物质溢出都起着重要作用[13-14]。Occludin 蛋白集中在细胞紧密连接纤维内，其完好性关系着紧密连接的完整性，而ZO-1 蛋白一旦被破坏，细胞的紧密连接会随之发生改变。刘海萍等[15]认为，仔猪早期断奶会破坏肠道黏膜结构，增加肠道通透性，可能是由上皮细胞紧密连接蛋白Occludin表达下降所引起。Troeger 等[16]依据患者十二指肠病样Claudin-4 和Claudin-7 不表达，Claudin-2 弱表达，而Claudin-1 表达显著减少，推测Claudin-1 表达降低引起紧密连接功能受损，并导致水和离子漏到肠腔内，从而引起腹泻。本研究结果显示，饲粮中添加0.04%、0.06% 白术茯苓多糖复方能显著增加仔猪空肠黏膜ZO-1、Occludin和Claudin-1mRNA 的相对表达量，且随着白术茯苓多糖添加量的增加，ZO-1、Occludin和Claudin-1mRNA 相对表达量呈先增加后降低的趋势，说明白术茯苓多糖能提高断奶仔猪空肠黏膜的紧密连接性，从而改善断奶仔猪肠道健康。但用Western blot 法检测空肠黏膜ZO-1、Occludin 和Claudin-1 蛋白表达时，结果显示ZO-1 和Claudin-1 蛋白表达各组间差异并不显著，推测可能是由于蛋白的表达与mRNA 的表达存在时间差。

肠黏膜受损后，肠上皮细胞会参与伤口愈合的过程，该过程主要依赖伤口附近区域上皮细胞的迁移、增殖和分化之间的平衡。CDK 抑制因子、细胞周期蛋白及其依赖性激酶作为细胞周期调控因子，发挥着调控细胞周期的作用，而p21/CDKN1A 主要是通过调控CDKs 活性参与细胞周期的调控；但p21/CDKN1A 是p53 的靶基因，其表达水平受p53 的转录调控，参与由p53 介导的细胞DNA 损伤反应；当细胞损伤时，p53启动p21/CDKN1A 的表达，p21/CDKN1A 抑制cyclin/CDK 活性，使细胞停滞于Gl 期[17]。p21/CDKN1A 在体内外通常被认为具有抑制细胞增殖的作用，而正常野生型p53 活化后可抑制细胞的增殖、调控细胞周期、诱导细胞分化、细胞调亡等。同时，p21/CDKN1A 高表达可阻止细胞凋亡发生，这与p21/CDKN1A 能促使细胞周期阻滞，继而防止DNA 损伤或促进其修复有关[18]。本试验研究发现，与抗生素组、空白组相比，饲粮中添加0.04%、0.06%、0.08% 白术茯苓多糖复方能显著提高仔猪空肠黏膜CDKN1A 相对表达量，各组间仔猪空肠黏膜p53 mRNA 相对表达量则差异不显著，说明适量的白术茯苓多糖复方可通过调控CDKN1A基因的表达来抑制空肠上皮细胞的凋亡，促进其修复，但该调控途径可能属于非p53 依赖型。

4 小 结

本研究结果表明，白术茯苓多糖复方能有效改善断奶仔猪小肠黏膜形态结构，维持肠道正常的通透性，白术茯苓多糖的适宜添加量为0.06%；白术茯苓多糖复方能改善断奶仔猪小肠屏障功能，通过调控CDKN1A基因的表达来抑制空肠上皮细胞的增殖，并促进空肠黏膜ZO-1、Claudin-1和OccludinmRNA 的表达。