脂多糖刺激后不同时间点断奶仔猪回肠和结肠中转化生长因子β1 及Smads 信号通路的动态变化

黄菲菲，张 阳，汪 洋，李先根，王秀英，朱惠玲，刘玉兰，肖 勘

（武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室，湖北武汉 430023）

肠道不仅是营养物质消化吸收的主要场所，也是重要的免疫器官，能够抵御外来病原入侵[1]。应激会造成肠道屏障功能障碍，导致肠道通透性增加并引起黏膜损伤[2]。肠道损伤后的修复包括上皮细胞的增殖、分化、成熟和迁移等复杂过程[3]。Xu 等[4]研究发现，转化生长因子β（TGF-β）信号通路在肠黏膜损伤的修复中发挥着关键作用。

TGF-β是一类多肽细胞因子超家族，包括TGFβs、活化素和抑制素等[5]，其中TGF-βs 最受关注。哺乳动物基因组可编码3 种不同的TGF-β亚型，即TGF-β1、TGF-β2 和TGF-β3[6]，其中TGF-β1 在哺乳动物体内的比例最高，且能参与细胞的创伤修复过程[7-8]。TGF-β1 信号通路主要由Smads 分子介导[9]。Smads 蛋白接受信息并传递至胞内，发挥其信号传导作用[10]。Smads 蛋白分为受体激活型Smad（R-Smad，包括Smad2 和Smad3）、共介导型Smad（Co-Smad）和抑制型Smad（I-Smad，主要有Smad7）3 种。TGF-β1 能够促进伤口愈合[11]，还与仔猪断奶应激后肠道屏障功能的恢复有关，在TNF-α刺激后，TGF-β1 通过激活Smad 和MAPK 信号通路保护肠道完整性[12-13]。现阶段尚无与TGF-β1 及Smads 信号通路在仔猪肠道损伤后的作用时期和修复机制相关的报道。

本研究以脂多糖（LPS）构建肠道损伤模型，探究LPS 刺激后不同时间点，肠道损伤修复中的关键因子TGF-β1 以及Smads 信号通路的动态变化，为营养调控肠道损伤修复寻找合适的时间点和调控靶点。

1 材料与方法

1.1 试验试剂 LPS：大肠杆菌血清型O55:B5（购于Sigma 公司）；RNA 提取所用TRIzol 试剂、反转录所用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒以及实时定量PCR 所用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII 试剂盒均由宝日医生物技术有限公司（TaKaRa 中国）提供。

1.2 试验设计 选取42 头体重（7.09±0.9）kg 的21 日龄杜×长×大断奶仔猪（断奶仔猪由湖北奥登农牧科技有限公司提供），按注射LPS 后时间点（注射LPS 之前和注射LPS 后1、2、4、8、12、24 h）随机分成7个处理，每个处理6 头猪。日粮配方参照 NRC（1998）进行配制，日粮原料组成及营养成分见表1。

表1 基础饲粮组成及营养成分（风干基础）

1.3 样品采集 预试14 d 后，LPS 刺激组腹膜注射100 μg/kg体重（BW）的LPS，分别在注射LPS 之前（0 h）和注射LPS 后1、2、4、8、12、24 h 屠宰仔猪，剪取回肠和结肠肠段，剪开并弃除内容物，生理盐水冲洗，除去肠系膜及表面脂质后置于速冻管，在液氮中速冻，再转移到-80℃冰箱中储存待测。

1.4 mRNA 表达量测定

1.4.1 总RNA 提取与反转录 将回肠和结肠样品研磨，参照陈逢[14]的方法提取总RNA，根据Prime Script RT reagent kit 反转录试剂盒步骤将RNA 反转录为cDNA。

1.4.2 引物设计 根据NCBI 已知的猪TGF-β1、TGF-β1受体1（TGF-βR1）、TGF-βR2以及其下游Smads 信号通路上的关键信号因子Smad2、Smad3、共介导分子Smad4和抑制性分子Smad7基因序列，利用Primer Premier 6.0 设计引物，并由武汉擎科生物科技有限公司合成，引物设计见表2。

1.4.3 实时定量PCR 以回肠和结肠的cDNA 为模板，运用Real-time PCR 试剂盒，测定目的基因的mRNA表达量。数据分析以GAPDH为内参，采用Livak 等[15]的2-ΔΔCt法进行计算。

1.5 统计分析 采用SPSS 22.0 软件对数据进行独立样本t检验，1、2、4、8、12、24 h 分别与0 h 比较，结果采用平均值±标准误表示，以P≤0.05 为差异显著性标准，0.05＜P≤0.10 为具有显著性趋势。

2 结果

2.1 LPS 刺激后不同时间点断奶仔猪回肠TGF-β1以及Smads 信号通路关键基因mRNA 表达情况 如表3 所示，LPS 刺激后，回肠中的TGF-β1的基因表达在2 h迅速上升，2、4 h 均显著升高，至24 h 达到峰值（P＜0.01）；TGF-βR1、TGF-βR2虽然在1～12 h 无显著变化，但在24 h 时极显著升高；下游关键因子Smad2在1、4、12 h均显著上升，并在24 h 到达峰值（P＜0.01），Smad3在24 h 到达峰值（P＜0.01），共介导分子Smad4的mRNA表达量在24 h 也显著上升；同时，TGF-β1 信号通路的抑制性分子Smad7的mRNA 表达量也在2、8 h 显著上升，且在24 h 达到峰值（P＜0.01）。

2.2 LPS 刺激后不同时间点断奶仔猪结肠TGF-β1以及Smads 信号通路关键基因mRNA 表达情况 如表4 所示，LPS 刺激后，结肠中的TGF-β1及其受体TGF-βR1、TGF-βR2的mRNA 表达量在1～8 h 无显著变化，但是TGF-β1及其受体TGF-βR1在24 h 显著上升，TGF-βR2在12 h 时显著上升；Smad2、Smad4以及Smad7的mRNA 表达量在刺激后1～12 h 无显著性变化，在24 h时显著上升，而Smad3 的mRNA 表达量在8 h 显著升高，表明TGF-β1以及Smads 信号通路在结肠中被激活，但激活时间滞后于回肠。

表2 实时荧光定量PCR 引物信息

表3 脂多糖刺激后不同时间点断奶仔猪回肠TGF-β1/Smads 信号通路关键基因mRNA 表达变化

表4 脂多糖刺激后不同时间点断奶仔猪结肠TGF-β1/Smads 信号通路关键基因mRNA 表达变化

3 讨 论

肠道作为机体重要的消化吸收场所和免疫器官，是机体抵御内源性和外源性致病菌入侵的重要防线。肠道形态和功能的完整性在机体病理生理过程中起着关键作用。正常状态下，肠道的上皮屏障能够阻挡肠腔内的有害微生物和代谢产物进入体内，但受到应激时，肠道也最容易受到影响，环境温度、营养因素、细菌感染等诸多因素都会导致肠道损伤[2]。LPS 主要存在于革兰氏阴性菌，可通过激活机体的免疫细胞引起炎症信号通路激活，诱导炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1 等产生，造成肠道损伤[16]。刘玉兰等[17]研究表明，LPS 能够引起肠道损伤。因此，LPS 常被用以构建肠道损伤模型。

肠道损伤后的修复过程是近年来的研究热点。TGF-β1 属于多肽类细胞因子，具有多种生物学功能，它可以调节多种细胞的生长发育、增殖、迁移和凋亡，参与细胞外基质的形成、创伤修复、免疫调控等生理调节过程[18-19]。Mei 等[20]研究仔猪断奶时空肠和回肠TGF-β1 表达和分布的瞬时变化，推测TGF-β1 在肠道结构的修复中起到了重要的调节作用。在本研究中，仔猪回肠中的TGF-β1、Smad2、Smad7基因在LPS 刺激2 h 后迅速激活，且与TGF-βR1、TGF-βR2、Smad3、Smad4一起在刺激后24 h 达到峰值，表明该通路在此时全部激活，肠道的修复过程也同时启动。同时抑制性Smad7 也在24 h 达到顶峰，表明此时Smads 信号通路全面参与损伤后的修复，这可能与Smads 信号的反馈调节有关，防止TGF-β1 信号过度激活。Dignass[21]和Margadant 等[22]也发现，TGF-β1 在调节肠黏膜细胞迁移、增殖、分化以及上皮细胞的恢复中具有重要的调节作用。Howe 等[23]研究发现，T84 细胞跨膜电阻在TGF-β1 处理16 h 后显著升高，并在处理72 h 后到达峰值，在修复肠道屏障功能中发挥重要作用。汪洋[24]研究发现，LPS 刺激后，空肠绒毛在1 h 出现萎缩，绒毛高度在4～12 h 显著降低，绒毛深度在2～12 h 显著降低，且空肠绒毛的形态在24 h 时逐渐恢复，这表明TGFβ-1信号通路与肠道形态有相关性。同时LPS 刺激导致空肠炎性细胞因子（如TNF-α）的mRNA 表达量在1～2 h显著升高并达到峰值，随后逐渐下降恢复，这与本研究中回肠TGF-β1/Smads 信号通路相关基因的变化趋势相一致，说明肠道修复的时间与炎性因子的释放是同步的。

本研究还发现，仔猪结肠中的TGF-βR2、Smad3基因在LPS 刺激12 h 后迅速激活，且与TGF-β1、TGFβR1、Smad2、Smad4、Smad7一起在刺激后24 h 达到峰值，表明结肠的TGF-β1/Smads 信号通路在LPS 刺激损伤肠道后全面激活，参与肠道的损伤修复过程。但是结肠TGF-β1/Smads 信号通路激活时间滞后于回肠的激活时间。在小鼠模型上得出的结果与本试验类似。D'Arpino 等[25]使用链脲佐菌素诱导的小鼠糖尿病实验模型，发现TGF-β1/Smad 是糖尿病结肠组织重塑的关键成分。Hering 等[26]使用HT-29/B6 细胞模型，研究发现TGF-β1 通过增强claudin-4 的蛋白水平，从而产生屏障保护作用。本研究中回肠在2 h 就有TGF-β1/Smads 信号通路中关键基因TGF-β1被激活，而结肠直到8 h 才有Smad3基因被激活，TGF-β1更是在24 h 才有所增加，这表明结肠TGF-β1/Smads 信号通路的激活时间滞后于回肠，推测这可能与肠段的特异性有关，但是具体原因还需进一步研究。

4 结 论

本试验结果表明，LPS 刺激后会造成肠道受损，同时肠道损伤修复机制也立即启动，其关键修复因子TGF-β1 及其相关的Smads 信号通路迅速激活，从而参与肠道损伤后的修复过程。