FBXL3 和FBXL21 基因表达与苏尼特羊季节性发情关系初探

2020-12-21钟英杰向光明贺小云刘树军张效生张金龙储明星刘秋月

中国畜牧杂志 2020年12期

钟英杰，向光明，贺小云，刘树军，张效生，张金龙，储明星*，刘秋月*

（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业农村部动物遗传育种与繁殖重点实验室，北京 100193；2.乌拉特中旗农区畜牧业专项推进办公室，内蒙古巴彦淖尔 015300；3.天津市畜牧兽医研究所，天津 300381）

苏尼特羊是内蒙古优良的地方肉羊品种之一，以肉质嫩、口感好而著名[1]。但苏尼特羊是一种典型的季节性发情绵羊，其肉产量远远达不到人们的需求，因此很有必要阐明季节性发情的分子机制，寻找绵羊季节性发情的关键基因，从而利用分子育种改善其繁殖性能。影响绵羊季节性繁殖的因素有很多，包括纬度、温度、营养水平和湿度等[2-3]，而光照条件是影响绵羊季节性繁殖的主要因素，一般情况是绵羊在短光照条件下发情，长光照条件下不发情。研究发现位于下丘脑的核心生物钟控制着生物的各种生理节律，如冬眠、新陈代谢和繁殖等[4-6]。有研究进一步表明，哺乳动物繁殖是由一系列依靠激素影响的行为及生理活动组成，而这些过程又受生物钟的调控[7]。生物钟直接或间接接收到外界的光信号后，钟基因表达水平会发生变化[8]，通过调控松果体节律性合成和分泌褪黑激素（Melatonin，MEL），褪黑激素又通过神经内分泌作用影响下游的器官，最终导致动物生殖机能改变[9-10]。目前还不清楚在上游通路中光照如何引起钟基因表达水平发生变化，以及在发情周期转换的这个过程中钟基因的变化。

FBXL3基因编码蛋白是F-box 和LRR 蛋白家族的成员，也是SCF 泛素连接酶复合体四大主要成分之一[11]。最早于2007 年被3 个独自的团队发现，Siepka 等[12]发现了小鼠中的FBXL3基因的超时突变（Overtime Mutation，Ovtm）导致节律周期延长，Luca 等[13]发现FBXL3基因的滞后突变（After Hours，Afh）也会导致自发活性周期增长，Maggi 等[14]发现在哺乳动物中FBXL3 蛋白可以诱导CRY 蛋白的降解，从而激发CLOCK 和BMAL1 蛋白的转录活性。FBXL21是FBXL3 最近的相似物，其主要分布在细胞质中（FBXL3主要在细胞核中表达），它同样可以结合CRY 蛋白，阻止FBXL3 的泛素化从而使CRY 蛋白稳定表达[15]。Yoo 等[16]在小鼠中研究发现FBXL21有双重功能，它可以在细胞核中阻止CRY 蛋白被FBXL3 蛋白降解，在细胞质中促进CRY 蛋白的降解，FBXL21和FBXL3基因在细胞内不同的区域分布及平衡决定了CRY基因的表达，从而控制着哺乳动物昼夜节律周期的变化。Dardente 等[17]在绵羊中发现FBXL21和FBXL3基因的表达昼夜节律周期性，而且进一步研究表明两者作用与在小鼠中一样，FBXL3基因在各个组织内广泛表达，FBXL21组织特异性地在下丘脑SCN 中表达。目前很多研究发现FBXL3和FBXL21基因与人的各种疾病有关，如Wang 等[18]研究发现miRNA-4735-3p 可以通过调控FBXL3基因从而抑制非小细胞肺癌的迁移和增殖，Chen 等[19]研究发现FBXL21与爱尔兰人的精神分裂症有关，但目前还不清楚FBXL3和FBXL21基因与绵羊季节性发情是否相关。因此，本研究通过人工控光羊舍模拟了不同发情状态下苏尼特羊在短光照（发情期）和长光照（休情期）FBXL3和FBXL21基因的表达情况，同时探究不同光照时间点对生物钟基因FBXL21和FBXL3表达的影响，分析光照对生物钟的影响，从上游通路找到影响季节性发情的关键分子，为进一步理解季节性发情机制和分子育种提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验样品选择来自同一羊场、在相同饲养条件和环境中饲养、体重接近、年龄为3 周岁的18 只健康苏尼特母羊，根据本课题组前期预实验结果，构建成年苏尼特母羊双侧卵巢切除（OVX）模型，OVX 母羊饲养于人控光羊舍内。短光照（SP）为8 h 光照，16 h 黑暗；长光照（LP）为16 h 光照，8 h 黑暗。自然饲养条件下先转换为短光照，短光照后的第1 天记为短光照第1 天（标记为SP1），接着短光照转换为长光照，转换后的第1 天记为长光照第0 天（标记为LP0），长光照的第2 天，即完成第1 次完整长光照记为长光照第1 天（标记为LP1）。采样时间点分别为SP21、LP3、LP15、LP21、LP42 和LP49，每个时间点取3 只羊。每次均在同一天同一时刻采集下丘脑组织和血液。在最短时间内用专门处理过的RNA 实验取材用的手术器械采集动物下丘脑组织，一部分样品立即投入液氮保存，另一部分样品投入液氮速冻后转入-80℃低温冰箱中保存。

1.2 组织总RNA 的提取和检测及cDNA 第1 链合成采用动物组织总RNA 提取试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）加Trizol（Invitrogen，美国）提取各组织总RNA[20]，并用Nanodrop2000 检测提取RNA 浓度和OD 值，用1.0% 的琼脂糖凝胶电泳检测RNA 的完整性。反转录试剂盒合成获得cDNA 第1 链，反转录体系和反应条件见表1，具体步骤参照本实验室前期RNA提取和cDNA 合成的方法[20]。

1.3 引物合成FBXL3和FBXL21基因mRNA 的序列在GenBank 中的登录号分别为NM_001129739.1 和NM_001129738.1，利用Primer3 在线软件进行跨外显子引物设计，以β-actin（NM_001009784）作为内参基因。引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成。引物名称和序列、退火温度、扩增片段大小以及用途见表1。

表1 绵羊FBXL3 和FBXL21 基因的引物信息

1.4 实时荧光定量PCR 反应

1.4.1 实时荧光定量PCR 体系和程序实时荧光定量PCR 反应体系总体积为20 μL：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA 模板2 μL，RNase-Free ddH2O 6.4 μL。PCR 程序：95℃预变性5 s，95℃变性5 s，60℃ 30 s，40 个循环；反应结束后对熔解曲线进行分析。

1.4.2 标准曲线的建立将cDNA 样本5 倍稀释后，再进行2 倍梯度稀释获得5 个浓度梯度的cDNA 样品，以5 倍稀释的cDNA 样本浓度为1，则这5 个cDNA 样品的浓度梯度分别为1、1/2、1/4、1/8 和1/16。用这些cDNA 作为模板对目的基因和持家基因进行荧光定量PCR，以浓度梯度的对数值（10 为底数）为横坐标，以检测所得Ct 值为纵坐标，绘制目的基因和内参基因标准曲线。得到单一且锐利的熔解曲线，符合qPCR 的要求。

1.4.3 实时荧光定量PCR 检测实时荧光定量PCR 检测利用Roche Light Cycler®480 Ⅱ型荧光定量PCR 仪进行，以β-actin为内参基因，每个样品重复检测3 次。

1.5 统计分析荧光定量结果用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量[21]，用SPSS22.0 统计软件中的一般线性模型中的单因素方差分析的最小显著差异（Least Significant Difference，LSD)法对不同光照时间点之间目的基因相对表达量进行分析。

2 结果与分析

2.1 由短光照转长光照过程中FBXL3基因在苏尼特羊下丘脑中不同光照时间点的表达分析如图1 所示，由短光照SP21 转长光照LP3 时，FBXL3基因表达量显著升高，说明FBXL3基因在季节性发情转换调控中可能起着重要作用。而从不同时间点来看，其表达量从SP21 到LP3、LP15、LP21 依次显著增高，LP21 时到达峰值。LP21 到LP49 时又显著降低，这与哺乳动物由短光照（发情期）转长光照（休情期）过程中催乳素的分泌形式一样[22]，以及垂体中发情关键调控因子EYA3和TSHb基因表达趋势一样[23]。

图1 FBXL3 基因在苏尼特羊下丘脑中不同光照时间点的表达

2.2 由短光照转长光照过程中FBXL21基因在苏尼特羊下丘脑中不同光照时间点的表达分析由图2 可知，由短光照SP21 转到长光照LP3 时，FBXL21基因的表达量降低（P＜0.05），直到LP15 时到达最低值，在LP21 时FBXL21基因到达最高，在LP42 时显著降低，LP49 升高。

3 讨论

图2 FBXL21 基因在苏尼特羊下丘脑中不同光照时间点的表达

哺乳动物的核心生物钟位于下丘脑视交叉上核（SCN），也是季节性发情的调控中心[24]，动物机体直接或间接接收到外界的光信号经SCN 传至松果体，分泌褪黑激素（Melatonin，MEL）作用于下丘脑-垂体-性腺轴（Hypothalamic-Pituitary-Gonadal Axis，HPGA），从而对季节性繁殖进行调控[25]。Wood等[22]研究发现在长光照条件下，垂体结节部（Pars Tuberalis，PT）表达的褪黑激素受体感知到MEL 的变化后，PT 区一系列光照信号分子发生改变，如促甲状腺细胞中EYA3表达量上升，与其他因子一起活化TSHβ的表达，引起HPGA 生殖激素的变化。因此光照对生物钟的影响是最上游的调控通路，对整个发情过程起着关键作用。Dardente 等[17,26]在绵羊中研究发现FBXL3和FBXL21也是钟基因，但它可以通过泛素化调节核心分子CRY 的稳定来影响整个生物钟，从而对下游的各种生理节律产生影响。本试验探究苏尼特羊由发情期转非发情期过程中FBXL3和FBXL21基因表达的变化，从激素水平层次上来看，由短光照转长光照过程中催乳素浓度升高，抑制整个性腺轴的活性，导致哺乳动物进入休情期，具体的调控通路与EYA3和TSHb分子有关，而后由于长光照的回溯性，使其降低而后又升高[22]。FBXL3基因表达呈现这样的规律也证实了FBXL3基因也很有可能在长光照季节发情调控这一通路上。qPCR 结果表明，FBXL3基因最相近的同源物是FBXL21，由短光照转长光照FBXL21的表达量显著降低，说明它也可能在发情调控中起着作用。研究发现，FBXL3基因能使CRY 降解，FBXL21能使CRY更加稳定，且发现FBXL3基因功能缺失使周期延长，FBXL21基因缺失使周期延长[15]，推测FBXL21表达趋势应该与FBXL3相反，那么FBXL21在LP21 时间点应该存在一个相对最低值，而本研究却出现最高值，与预期的结果矛盾。有研究发现FBXL21基因有双重功能，在细胞质能使CRY 降解，而在细胞核中能拮抗FBXL3对CRY 的降解[16]，可能会导致出现与假想不一致的结果，而且本实验中qPCR 结果表明FBXL21整体表达水平较低，这可能是由于FBXL21基因属于钟基因，表达水平受昼夜节律影响，而采样时间恰好在FBXL21基因一天中的低表达时间点导致[26]。综上，节律钟基因的功能缺失会使生物钟正常功能受到影响，最终影响哺乳动物的发情排卵[27-29]；本研究发现FBXL3基因的表达模式与长光照条件下发情调控因子（基因）表达一致（如EYA3和TSHb等），同样与催乳素分泌趋势也一致，推测FBXL3基因很有可能是长光照季节发情调控的关键因子，且在上游影响下丘脑核心生物钟来实现对整个发情通路进行调控，而FBXL3基因同源物FBXL21也可能在这个过程中起着重要调控作用。