循环肿瘤细胞在胃癌临床分期判断、疗效监测及预后评估中的价值

刘霞，董丽娟，张军鹏，贺继东，薛海兰，王顺

宝鸡市人民医院消化内科1、检验科2，陕西 宝鸡 721000

胃癌是消化系统常见恶性肿瘤之一，据国际癌症研究机构统计数据显示，2012年全球胃癌新发病例约95.1万例，死亡病例约72.3万例，其发病率和死亡率分别居全球恶性肿瘤的第四位和第三位，多发生在发展中国家[1-2]。据2012年我国肿瘤登记中心数据显示，胃癌新发病例约42.4 万例，死亡病例约29.8 万例，约占全世界的50%，疾病负担重[3]。大多数胃癌患者确诊时已处于中晚期，失去最佳治疗时机及方案，预后较差[4]。此外，转移复发亦是影响胃癌预后的重要原因，血行转移是其主要方式，与循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)相关，外周血中CTCs数量稀少，对检测方法有较高的要求，研究受限[5-6]。近年，随着检测技术不断完善，CTCs检出率明显升高，其作为一种新型非侵入性诊断工具，在乳腺癌、肺癌等恶性肿瘤早期诊断、疗效评估及预后预测中展现出巨大的价值[7-8]。本研究旨在探讨外周血CTCs在胃癌临床分期判断、疗效监测及预后评估中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取 2015 年 6 月至 2017 年 6 月于宝鸡市人民医院消化内科诊治的130 例胃癌患者(胃癌组)纳入研究。纳入标准：①术前胃镜取活检病理确诊为胃癌者；②入组前未给予任何抗肿瘤治疗者；③均行胃癌根治性手术者；④治疗依从性好。排除标准：①孕期或哺乳期患者；②存在远处转移者；③合并其他任何恶性肿瘤者；④合并肝肾功能及凝血功能障碍者。胃癌组患者中男性90 例，女性40例；年龄22～80 岁，平均(49.24±10.46)岁；按美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)第 7 版 TNM 分期标准[9]，其中Ⅰ期 23 例，Ⅱ期39 例，Ⅲ期 68 例；T1～2期 51 例，T3～4期 51 例 79 例；N0期40 例，N1～3期 90 例。选取同期 40 例健康体检者作为对照组，其中男性 27 例，女性 13 例；年龄25～78 岁，平均(50.11±10.92)岁。两组受检者的性别和年龄比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。本研究已通过本院伦理委员会批准[批件号：2020 伦委会字第(001)号]，所有受检者自愿参加本研究，且签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 采用EDTA抗凝采血管收集健康对照组和胃癌组(入组后第1 天和术后第3 天)外周血5 mL，颠倒混匀10 次(抗凝血)，若不能及时进行后续实验，须在2℃～8℃保存。

1.2.2 外周血CTCs 富集[8]采用CanPatrolTMCTC-二代捕获技术完成外周血CTCs富集，具体操作如下：第一，加红细胞裂解液，混匀，室温静置30 min，1 850 r/min 离心10 min，去上清；第二，加固定剂混匀静止8 min，后将其与纳米滤膜过滤器和真空泵连接，制备得到细胞滤膜，实现CTCs纳米技术截留及富集，最后用甲醛固定60 min。

1.2.3 RNA 多重原位杂交分析(RNA in situ hybridisation，RNA-ISH)[10]固定后，将细胞滤膜依次进行亲水-透化-消化-探针杂交-预扩增-扩增-显色7个步骤，后在样本上加抗淬灭剂(含DAPI)，放置5 min后在自动识别系统上完成荧光信号识别(CTCs 类型不同，荧光信号不同)，其仪器为FACS Canto Ⅱ流式细胞仪(购自美国BD 公司)。其中上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)基因探针包括EpCAM、CK8、CK18、CK19、Vimentin、Twist 和 CD45。参考RNAscope Multiplex Assay Kit 试剂盒(购自美国Thermo Fisher公司)说明书进行判断，CTCs判断标准：CTCs 阳性-CTCs 数量≥2 个/5 mL，CTCs 阴性-CTCs数量＜2个/5 mL；CTCs分型判断标准：上皮型CTCs显示为红色荧光信号点(CD45 表达阴性；EpCAM/CK8/CK18/CK19表达阳性)，间质型CTCs显示为绿色荧光信号点(CD45表达阴性；Vimentin/Twist表达阳性)，混合型CTCs同时显示红色和绿色荧光信号点。

1.3 随访 出院后对130 例胃癌患者进行随访，包括电话和门诊复诊，共随访3 年，截止日期为2020年7月，终点事件为复发和死亡，记录其无进展生存期(progression-free-survival，PFS)和 总 生 存 期 (overall survival，OS)。

1.4 统计学方法 采用SPSS20.0 统计学软件分析数据，采用χ2检验分析CTCs 与胃癌临床分期的关系，采用Wilcoxon (W)检验分析CTCs 与胃癌疗效的关系，采用Kaplan-Meier法和Log-rank法分析CTCs与胃癌预后的关系，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受检者的CTCs检测结果比较 对照组受检者CTCs 检测均为阴性；胃癌组患者中，CTCs 阳性者117例(90.00%)，其中CTCs均数为5(0～42)：上皮型均数为1.8(0～20)、混合型均数为3.5(0～42)和间质型均数为1.5(0～8)，见图1。

图1 CTCs分型(×400)

2.2 CTCs 与胃癌临床分期的关系 CTCs 检出率在不同T 分期、N 分期和AJCC 分期上比较差异有统计学意义(P＜0.05)；CTCs 分型在不同 N 分期和AJCC分期上比较差异有统计学意义(P＜0.05)，但在不同T分期上比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

2.3 胃癌患者手术治疗前后CTCs 检出率和CTCs分型比较 术前、术后胃癌患者CTCs检出率和CTCs分型比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表1 CTCs与胃癌临床分期的关系[例(%)]

表2 胃癌患者手术治疗前后CTCs检出率和CTCs分型比较[例(%)]

2.4 CTCs与胃癌预后的关系 截至随访终止日期，所有胃癌患者均未失访。117例CTCs阳性胃癌患者中，45 例进展，72 例未进展；40 例死亡，77 例生存；13例CTCs阴性胃癌患者中，2例进展，11例未进展；1例死亡，12例生存。CTCs阴性胃癌患者和CTCs阳性胃癌患者无进展生存率[85%(11/13)vs 62%(72/117)]和总生存率[92(12/13) vs 66%(77/117)]比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，见图2。CTCs阳性胃癌患者中，CTCs 上皮型、混合型和间质型的患者无进展生存率[(84%(26/31)vs 69%(34/49)vs 32%(12/37)]和总生存率[94%(29/31)vs 73%(36/49)vs 32%(12/37)]比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，见图3。

图2 CTCs检测与胃癌预后的生存曲线图

图3 CTCs分型与胃癌预后的生存曲线图

3 讨论

近年，我国经济发展迅速，生活环境和国民生活方式均改变明显，胃癌发生率明显升高，但预后无明显改善，与复发转移有关[11]。1896年，ASHWORTH[12]从在研究转移性肿瘤时发现，患者血液中存在一种与肿瘤细胞极为相似的血细胞，并提出了CTCs的概念，表明外周血中检测到的CTCs 主要来源于原肿瘤灶，通过相关通路到达相应器官并形成转移灶。有文献报道，肿瘤患者在某些尚未形成能够被影像学所发现的转移灶之前，外周血中CTCs检测已存在阳性，提示CTCs检测对肿瘤转移复发意义重大[13-14]。

随后，越来越多研究提示，外周血CTCs在肿瘤诊断、治疗及预后评估中具有重要价值[15]。但由于技术限制，CTCs在临床应用较少。目前，CTCs检测方法包括光导纤维阵列扫描(fiber-opticarray scanning technology，FAST)、激光扫描细胞计量技术(laser scanning cytometry，LSC)、CTC 芯片技术、酶联免疫斑点技术(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT) 及 Cell-Search System等，其中最具代表的是经美国食品和药品管理局(food and drug administration，FDA)批准并用于临床的 CellSearch 系统[16-17]。与 CellSearch 一代不同，CanPatrolTMCTC-二代捕获技术不仅利用纳米滤膜快速富集CTCs，还以 EpCAM、CK、Vimentin、Twist、AKT 及Snail 等多种标志物mRNA 为靶标进行RNA原位杂交以进行CTCs分型，具有高灵敏性、高特异性及可重复性等优点[18]。

在本研究中，40 例健康体检者CTCs 检测均为阴性，130例胃癌患者中CTCs阳性者117例，检出率高达90.00%，与T 分期、N 分期和AJCC 分期相关，分期越晚，CTCs 检出率越高，提示CTCs 可能通过相关信号通路参与胃癌的发生发展，与杨艳丽等[19]研究结果基本一致，再次强调了CTCs在胃癌中的价值。随后，本研究还探讨了CTCs检出与胃癌手术治疗前后和预后的关系发现，术后CTCs 检出率明显低于术前，CTCs阳性者 PFS 和 OS 均低于 CTCs 阴性者，提示 CTCs 检测对胃癌疗效评估和预后监测有一定价值，为本文重要创新点之一，为胃癌患者诊疗提供了新的方向。

研究发现，多数肿瘤细胞在从原发灶脱离进入血液循环后会发生上皮-间质转变，根据此特征可将CTCs可分为上皮型、间质型和混合型(上皮-间质)，以间质型恶性程度最高[20]。在本研究117 例CTCs 阳性患者中，上皮型、混合型和间质型CTCs 分别为30 例、50 例和 37 例，T 分期、N 分期和 AJCC 分期越晚，间质型CTCs占比越大，与前述结论基本一致。此外，本研究还探讨了CTCs分型与胃癌手术治疗前后和预后的关系发现，术前术后CTCs 分型差异明显，以间质型CTCs 减少为主；CTCs 分型不同，其 PFS 和 OS 比较差异明显，以间质型CTCs 患者PFS 和OS 生存率最低，生存时间最短，提示CTCs 分型在一定程度上可代表胃癌恶性程度，评估其疗效，预测其预后，在一定程度上可完善胃癌诊疗系统。

综上所述，CTCs 在胃癌中检出率高，且具有不同分型，与临床分期、疗效及预后密切相关，综合CTCs总数和分型检测，为胃癌患者诊疗及预后提供新的方向。但本研究样本量和观察时间均相对有限，今后将通过扩大样本量和延长观察时间验证本研究结论，以便推广。