高通量测序在肝硬化患者腹水、血清及粪便微生物群检测中的应用

李 真， 张 维， 贾 琳， 胡中杰

首都医科大学附属北京佑安医院 肝病重症医学科， 北京 100071

二代测序，又称高通量测序，是对一个物种的几十万到几百万DNA分子基因组和转录组同时进行测序，经生物信息学分析鉴定出标本中所含核酸的种类, 并可获得该物种的序列数、覆盖度等定量分析数据，从而全面分析该物种。二代测序具有检测速度快、准确率高、成本低、覆盖面广以及产出巨大等特点[1]。目前，二代测序在医学方面已经运用于肿瘤、寄生虫病、遗传病、基因水平检测等多种疾病的检测、预防及治疗[1]，该技术也有助于肝硬化患者并发感染的诊治，值得进一步关注。

临床上，肝硬化患者极易发生细菌感染，感染发生率是一般人群的4～5倍[2]，尤其是住院患者，其细菌感染发生率高达25%～40%[3]，临床以自发性细菌性腹膜炎(spontaneous bacterial peritonitis，SBP)最为多见[4]。感染是肝硬化患者常见的并发症及常见死亡原因之一[5]。肝硬化患者感染症状隐匿，对于怀疑感染者必须尽早进行病原学检查，以便获得药敏结果以指导临床治疗，降低病死率。SBP的诊断和治疗是临床实践中的难点，因此需引入新的诊疗体系。值得关注的是，人体肠道微生物群构成了一个稳态平衡、共生生态系统[6]。虽然已有研究[7]发现人类疾病与肠道微生物的多样性、数量以及丰度分布相关，但其因果关系尚不明确，需要更深入的研究。亦有研究[8]表明，肝硬化的发展可能与肠道微生物群结构变化有关。现就二代测序在肝硬化方面的应用综述如下。

1 二代测序在肝硬化腹水微生物群的应用

目前，临床上常规应用腹水细菌培养方法获得SBP致病菌，但细菌培养耗时长，且因大量腹水的稀释以及预防性广谱抗生素的应用，导致腹水培养阳性率为10%～60%[9]。此外，细菌培养技术无法检测出苛养菌、胞内菌、病毒等病原体[10]。二代测序技术的出现为腹水病原学诊断提供了一种更为精准的方法[1,11]。2015年，Feng等[12]通过二代测序技术和16sPCR方法，对有或无SBP的肝硬化腹水患者进行腹水菌群鉴定，发现在同一个标本中二代测序对于细菌DNA分子更敏感，即使是低丰度细菌也能够识别。在这些检测标本中，大肠杆菌占所有检测细菌丰度的一半以上，革兰阳性菌感染呈上升趋势。该研究表明，二代测序技术是鉴定肝硬化腹水或其他低丰度细菌DNA标本微生物学的有力方法。此外，Engelmann等[3]收集173例失代偿期肝硬化患者的腹水样本，采用定量PCR及二代测序(Ripseq测序平台)对细菌DNA阳性的腹水样本进行测序，发现白细胞性腹水和非白细胞性腹水检测出细菌DNA的概率相近(40% vs 43.5%)，且腹水细菌DNA水平>520 拷贝/ml患者的30、180 d存活率大大降低；而腹水细菌DNA水平>5000 拷贝/ml的患者预后最差。上述研究表明，患者的生存率与腹水细菌DNA水平显著相关。同时，进一步通过Ripseq测序平台对细菌DNA阳性腹水样本测序，发现腹水细菌谱主要是革兰阳性菌株[13]，该研究结果与近年来腹水细菌DNA的检测结果是一致的，即83.8%的检测细菌是革兰阳性菌[14]。这些实验数据提示，近年来革兰阳性腹水感染逐渐在增加。因此，近年来有学者建议将细菌DNA检测作为细菌易位的标志。通过二代测序技术检测腹水中的细菌DNA，发现腹水中的细菌不仅仅可以来自肠道，也可来自皮肤定植菌[15]，或者菌血症患者血液中的细菌[16]。Rogers等[15]选取25例肝硬化腹水的患者，通过实时定量PCR方法对腹水标本中总细菌载量进行定量，并进一步应用焦磷酸测序技术鉴定细菌种类和相对丰度，发现腹水标本中除了肠道相关的菌群，还有其他许多非肠道微生物，如机会性感染相关的需氧菌属，包括不动杆菌、假单胞菌、拉尔斯顿菌、寡养单胞菌和葡萄球菌；也有来自于皮肤定植菌，如丙酸杆菌属。由此可见，治疗SBP患者选择抗生素时具有一定困难，一般抗生素不可能覆盖如此广泛的微生物种类。因此，利用二代测序技术更加准确快速检测腹水主要致病菌，指导临床抗生素治疗，对提高患者生存率至关重要。

2 二代测序在肝硬化血清微生物群的应用

既往研究多应用传统的PCR技术检测肝硬化患者血标本中的微生物，但是检测率低，且检测到的大多数细菌十分单一，多为大肠杆菌或金黄色葡萄球菌[17]。Santiago等[18]通过二代测序技术对7例健康对照者与27例肝硬化患者的血清微生物标本组进行测序，同时也对比分析11例肝硬化腹水患者的腹水和血清微生物标本，发现在肝硬化患者的血清和腹水中均能检测到复杂且特异的微生物群落，以厚壁菌和拟杆菌最丰富，而健康对照组的血清标本中几乎检测不到。与不伴有腹水的肝硬化患者相比，肝硬化腹水患者血清中以梭菌属最具有多样性，且相对丰度较高，通过β-多样性分析发现血清和腹水标本中微生物组成相似。同样，该研究表明，相较于无腹水的患者，肝硬化腹水患者的炎症状态明显增加。有趣的是，Caro等[19]通过对77例肝硬化腹水患者的血清和腹水标本进行细菌DNA测序，鉴定细菌种类，发现细菌易位的细菌类型(革兰阴性或革兰阳性细菌)对于炎症反应影响程度不同，当其血清和腹水中存在革兰阴性菌DNA时，炎症因子TNFα、IFNγ和NO浓度较高；且TNFα水平与细菌DNA浓度和脂多糖(LPS)呈显著相关。而NO浓度与细菌DNA浓度显著相关，但与LPS水平无关；INFγ和IL-12的水平与细菌DNA和LPS水平均无显著相关性。结果表明，血浆中的细菌DNA浓度是与炎症反应最准确相关的因素。因此，对肝硬化感染高风险患者使用诺氟沙星初步预防，不仅可以显著降低SBP的发生率，也可降低肝肾综合征的发生率[16]。此外，肝硬化患者若存在菌血症，微生物可以通过非细菌易位途径，转移至腹腔，从而导致SBP的发生。有研究[15]在有宠物接触史的SBP患者腹水中发现有巴氏菌、蜡样芽孢杆菌，表明肝硬化患者若存在菌血症，也可能导致腹水感染。

综上所述，通过二代测序技术系统分析肝硬化并发SBP患者血液的微生物组学特征，同时引入同源性分析，从宏基因组学方面深入探究细菌易位的方式，有助于阐明SBP的发生机制。同时，通过表征SBP微生物组学特征，有助于指导临床抗菌药物的选择和精准抗感染治疗。

3 二代测序在肝硬化粪便微生物群的应用

肝硬化患者若合并门静脉高压症，因胆汁酸分泌减少、门静脉高压、肠黏膜屏障受损，肠道黏膜上皮通透性增加[20]，影响肠道微生物群的组成和生长。肠道微生态失调与肝硬化的发病机制及终末期肝病的发生发展存在因果关系[21]。大多数肠道细菌无法直接培养，难以对其进行全面分析。二代测序技术解决了这一难题，使得对微生物的多样性分辨及物种的定性、定量分析成为可能[22]。更多的二代测序实验结果显示，肝硬化患者的肠道微生物群发生变化，对肝脏有益的微生物群相对减少，但致病类微生物群(如葡萄球菌科、肠杆菌科和肠球菌科)相对过度生长[23]，表明肠道微生物菌群的变化是肝硬化患者病情进展程度相关的独立因子[24]。Chen等[25]收集36例肝硬化患者和24例健康人群的粪便微生物标本，对16S核糖体RNA V3区域采用454焦磷酸测序，分析粪便微生物群，发现肝硬化患者的粪便微生物群落潜在致病细菌(如肠杆菌科、链球菌科)增多，有益细菌(如双歧杆菌、毛螺菌)减少；Child-Turcotte-Pugh评分与链球菌科呈正相关，与螺菌科呈负相关，提示肠道微生物群的改变可能影响肝硬化患者的预后。该研究结论也被其他团队的研究验证，如Qin等[26]通过定量宏基因组学分析了肝硬化患者的肠道微生物群，表明肝硬化的发展可能与肠道微生物群结构变化有关；Wei等[27]采用高通量Solexa测序分析粪便中微生物群落和功能，发现肠道菌群的改变与疾病的严重程度呈正相关[28]。Santiago等[18]采用16S核糖体DNA高通量测序对27例肝硬化患者与17例健康对照人群的粪便微生物组进行比较，发现健康人群的粪便微生物群落较肝硬化患者具有更高的多样性，提出血清和粪便微生物组成的改变可作为肝硬化进展的指标。Rogers等[14]对25例肝硬化腹水患者，通过焦磷酸测序技术鉴定细菌种类及相对丰度，发现在肝硬化患者的肠道菌群中，以变形菌门最多(53.9%)，其次是厚壁菌门(21.2%)、放线菌门(17.4%)和拟杆菌门(4.4%)。而健康个体的肠道菌群以拟杆菌门和厚壁菌门为主，肝硬化患者的肠道菌群中，拟杆菌门的相对丰度下降，变形杆菌和梭菌门的相对丰度增加，其中链菌科的增加与肝硬化严重程度呈显著正相关趋势。研究[29]表明，肠道菌群变化可以提示肝硬化进展，且在此研究基础上，可以通过关注肠道微生物群的变化帮助研发新的治疗肝硬化的方案，以肠道微生物作为慢性肝病治疗靶向。

4 二代测序目前的挑战

目前，二代测序技术在病原学诊断方面显示了独特的优势，其快速、精准的特性很好地补充了病原学诊断方法。然而，对于一些胞壁较厚，难裂解的真菌或细菌，二代测序在测序时存在一定的假阴性[30]。此外，测序覆盖度与病原体基因组大小有关，病毒的测序覆盖度远高于细菌、真菌及寄生虫，测序时可能导致致病菌判断失误或遗漏[31]。并且，二代测序在正常健康人血液和粪便中可以检测到多种微生物的存在，肝硬化患者亦如此。因此，判断测序检出的微生物为致病菌还是污染菌极为重要。其测序结果的判读往往还需要与临床相结合，目前为止尚未单独依靠测序结果判断污染菌或致病菌，这是二代测序的局限性。二代测序是基于对标本的游离DNA检测，但死菌释放的游离DNA也是可检测的，若患者接受抗生素治疗[32]或合并创伤、肿瘤[33]，其测序结果也会随之被影响。Rogers等[34]在提取DNA之前，采用叠氮溴化丙锭预处理标本可以清除死菌释放的游离DNA，虽然此方法未经过其他研究验证，但仍值得参考。二代测序是提取标本中的全部核酸片段加以检测，理论上可以检测细菌耐药基因的核酸序列。但是往往测序结果只能达到鉴别微生物种属的级别[35]，并不能全面检测耐药基因。因此，治疗时抗生素选择还是要靠临床医生的经验。上述问题均需要日后更为深入的研究、探索。但可以肯定的是，随着测序技术、生物信息学的迅速发展，在未来几年内临床测序应用将越来越广泛。