水貂生长性状相关基因的分子遗传标记研究进展

宋姗姗，宋兴超，张如，丛波，刘琳玲

（中国农业科学院特产研究所，农业农村部特种经济动物遗传育种与繁殖重点实验室，吉林省特种经济生物学省部共建国家重点实验室，吉林 长春 130112）

水貂皮被称为“裘皮之王”，每年的贸易量约占国际裘皮贸易量的70%[1]，在水貂育种中，与活体毛皮等级及干皮品质相关的性状均处于强选择状态，公、母水貂体重遗传力分别为 0.48 和 0.43，公、母水貂皮张长度的遗传力均为 0.45[2]。因此，对水貂生长性状（如体重和体长）相关基因进行深入研究显得尤为重要，并且培育体型大且毛皮品质优良的新品种已成为当前水貂育种的目标之一。20 世纪80 年代，遗传标记即分子遗传标记技术应运而生，该技术可准确、有效地揭示物种的遗传变异特性[3-4]，遗传标记经历了四个阶段，即形态学标记、细胞学标记、生化标记和DNA 分子标记。伴随DNA 重组技术的出现，科学家开始研究DNA 多态性的遗传标记方法，这使分子遗传标记技术辅助常规动物育种成为可能。分子遗传标记技术的出现在很大程度上提高了育种的有效性，因而分子遗传标记技术在水貂育种领域备受关注。目前，应用较广泛的分子遗传标记主要有限制性片段长度多态分析技术（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、DNA指纹分析技术（DNA fingerprint）、随机引物扩增多态性 DNA 技术（random amplified polymorphism DNA，RAPD）、短段串联重复序列（short tandem repeat，STR）和扩增片段长度多态性分析技术（amplified fragment length polymorphism，AFLP）。本文将概述分子遗传标记技术在水貂生长性状相关基因中的应用研究现状，旨在为今后该技术在水貂育种中的应用提供参考。

1 水貂生长性状相关基因分子遗传标记

2007 年，Anistoroaei 等[4]首次获得水貂简单重复序列（SSR）标记的遗传图谱，并且经过2 次补充完善[5-6]。Thirstrup等[7]利用该遗传图谱发现影响毛皮质量和皮张长度的数量性状位点（quantitative trait locus，QTL）；此外，Cirera 等[8]发现 TYRP1 基因内含子 2 中一个长插入片段与美洲水貂帕洛米诺毛色表型存在关联；同时采用细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC）文库测序，在水貂基因组中进行同源搜索查找生长相关基因[9]。Thirstrup 等[10]采用限制性酶切位点关联DNA 测序技术（restriction-site-associated DNA sequencing，RAD-seq），在水貂中检测到380个SNPs。大量研究表明高通量测序技术已在水貂育种中广泛应用，用高通量测序技术构建不同类型的基因组DNA 文库，并进行序列测定。然后使用生物信息学方法对测序得到的序列进行拼接、组装和注释，从而获得该物种完整的基因组序列信息。Cai 等[11]首次报道水貂全基因组序列信息，这使得鉴定整个水貂基因组中的单核苷酸多态性（SNP）成为可能。Cai 等[12]采用高通量测序技术获得2 496 只北美水貂的SNP，经过多轮筛选，保留28 336 个高质量SNP 和2 352 个个体用于全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）。针对水貂体重、行为以及与貂皮质量有关的 10 个性状进行全基因组关联研究（GWAS），发现WWC3、MAP2K4、SLC7A1 和 USP22 基因可作为水貂体重和毛皮长度的候选基因。2019 年荣敏等[13]利用Illumina HiSeqTM2500 高通量测序平台构建转录组文库对美国短毛黑水貂快速生长过程中差异显著性基因进行分析，研究发现与肌肉生长相关显著富集GO 条目有66 条，其中44 个相关基因差异表达，这些差异基因可能调控水貂的快速生长，可以为下一步深入研究提供数据。

动物的生长轴为GH-GHR-IGF-1-IGF-1R，这些基因均可调控动物机体的生长发育。生长激素（GH）是一种单链蛋白质，几乎能作用于机体所有类型的组织和细胞，通过影响骨细胞和软骨细胞的分化和调节机体的脂肪代谢来调控机体的生长发育[1]，下面将分别阐述水貂生长性状相关基因的分子遗传标记。

1.1 生长激素

生长激素（GH）是一种肽类激素，由垂体中的生长激素细胞合成和分泌，通过双重作用机制促进成骨、破骨细胞的增殖，从而调控机体的生长发育[14]。2010 年，李玉梅等[15]采用PCR-SSCP（PCR-single strand conformation polymorphism）方法研究水貂GH 基因多态性，结果显示BB 基因型个体与AA 基因型个体皮张长度有显著相关。关联分析发现合并基因型与水貂皮长性状差异显著。同年，李玉梅等[16]采用同种方法研究发现C→A 突变产生的3 种基因型与水貂体重具有相关性，BB 基因型个体体重高于AA 基因型个体，2 次研究均采用PCR-SSCP 方法共同证实GH 基因可作为水貂生长性状相关的候选基因，PCR-SSCP 作为一种分子遗传标记技术，是一种快速检测基因的单个核苷酸变异的方法。上述检测水貂GH 基因的2 个突变位点可作为水貂皮长和体重性状的遗传标记位点，为进一步利用分子标记辅助选择开展水貂新品种选育提供科学依据。

1.2 胰岛素样生长因子 1

胰岛素样生长因子 1（IGF-1）是细胞生长的重要调控因子[17]，肝脏可分泌体内循环的IGF-1，前人研究发现动物的生长发育与其血液中IGF-1 浓度有关[18]。目前，IGF-1 基因作为影响动物生长的主控基因而成为研究热点。研究发现，IGF-1 在胚胎期可以促进胎儿软骨膜和软骨细胞的生长发育[19]，该基因再与GH 协同作用，重组的IGF-1 能刺激红细胞的生成。荣敏等[20]对6 个水貂群体进行IGF-1 基因与生长性状的关联分析，首次并未发现该基因与水貂生长性状具有相关性，但经过再次试验发现2 个SNPs，其中1 个外显子内存在一处C→G 突变的杂合型AB 型个体体重和皮张长度高于纯合 AA 型，具有极显著差异[21]。随着研究的深入，霍自双[22]发现IGF-1 基因的g.6 194G>A 突变位点对红眼白水貂的体长有极显著影响（P ＜ 0.01），g.71 699C ＞ A 突变位点与体长显著相关（P ＜ 0.05）。单核苷酸多态性（SNP）分子遗传标记是继限制性片段多态性（RFLP）与微卫星标记（SSR）后产生的新一代分子标记，其特点是分布不均匀、丰度高和自动化检测。当前，该技术已广泛应用于分子标记辅助选择育种，上述研究获得水貂 IGF-1 基因的3 个SNPs 可作为红眼白水貂体长性状的遗传标记，今后应逐步构建并完善水貂SNP 遗传图谱，分析筛查到的候选基因突变位点与经济性状的相关性，以期进一步丰富水貂分子遗传学相关研究。

1.3 胰岛素样生长因子 1 受体

胰岛素样生长因子 1 受体（IGF-1R）基因作为生长轴的终端与 IGF-1 结合形成复合体发挥生物学作用，可使IGF-1R 的酪氨酸残基发生磷酸化，从而激活磷酸肌醇 3-激酶（PI3K）和 Ras 蛋白信号通路来阻断细胞凋亡[23]，调控GH 的分泌、影响机体生长发育以及促进细胞凋亡、增殖和分化[24-25]。宋姗姗[26]以大体型的银蓝水貂和小体型的美国短毛黑水貂为研究对象，研究IGF-1R 基因与生长性状相关性，结果显示c.1 782G ＞ A 与美国短毛黑水貂体重显著相关（P ＜0.05），且杂合型AA 型个体体重大于其他2 个基因型个体。2019 年进一步研究，以红眼白水貂、金州黑水貂和咖啡水貂为研究对象，筛查IGF-1R 基因CDS 序列的突变位点，推断得出 c.207G ＞ A 与金州黑水貂和咖啡水貂体长性状显著相关（P ＜ 0.05），其中金州黑水貂野生型GG 基因型为优势基因型；c.1 782G ＞A与咖啡水貂的体长显著相关（P ＜ 0.05），c.1 782G ＞A 与咖啡水貂的体重差异极显著，其中突变杂合GA基因型为优势基因型。合并基因型分析发现：金州黑水貂不同合并基因型与水貂体长、体重均差异显著，GAGG 基因型个体的体长和体重均显著高于其他基因型个体[27]。初步推断GGGA 基因型可能是影响金州黑水貂体长与体重的有利基因型，综上2 次试验认为IGF-1R 基因可能是影响水貂生长性状的候选基因。通过研究 5 个种群水貂 IGF-1R 基因并筛查到 SNP 位点，该位点可作为水貂生长性状选育的分子遗传标记，为培育大体型的优良水貂品种奠定了理论基础。

1.4 阿片黑素促皮质激素原

阿片黑素促皮质激素原（pro-opiomelanocortin，POMC）是垂体多种激素的前体，相关肽有黑素皮质素、促肾上腺皮质激素（adrenocor ticotropic hormore，ACTH）和促脂素（lipotrophic hormone，LPH）三大类，可调节食物的摄入，并且影响机体的能量平衡[28]。研究发现 POMC 基因序列位点的突变可以影响机体的进食量，从而决定机体的体重[29]。刘琳玲等[30]筛查到POMC 基因存在 4 个变异位点，g.171A ＞ G 位点与咖啡貂的体重有显著相关，AA 型为优势基因型，个体体重最高；g.470T ＞G 位点与咖啡貂的体长具有相关性，TT 基因型为优势基因型；g.470T ＞G 位点与红眼白水貂的体重显著相关，TT 型为优势基因型；g.514C ＞T 位点与红眼白水貂的体长差异显著（P ＜0.05），CT型个体体长大于CC型和TT型个体。研究发现POMC基因的变异可影响水貂的体长与体重性状，还发现POMC基因具有丰富的遗传多样性，得出水貂的POMC 基因g.171A ＞ G 和 g.470T ＞G 这 2 个突变位点可作为咖啡水貂和红眼白水貂体长和体重性状的分子遗传标记位点。

1.5 垂体特异性转录因子

垂体特异性转录因子（PIT-1）是POU 结构域中的一种蛋白，也是一种DNA 结合蛋白，可调节机体细胞分化，调控垂体激素分泌细胞基因的转录，从而影响动物机体的生长发育[31]。杨洪雁[32]采用 PCR-RFLP 方法，检测了水貂PIT-1 基因多态性并与水貂生长性状进行关联分析，结果表明，C43T 突变位点与水貂体重、胸围和腹围性状差异极显著（P ＜0.01），A143G 变异位点与水貂体长、体重、体高、胸围和腹围性状差异极显著（P ＜0.01），DD 基因型为优势基因型。进一步发现合并基因型 AADD 基因型个体的体重、胸围、屠宰体重显著大于BBCC 基因型个体，BBDD 基因型个体体长显著大于其他基因型个体（P ＜ 0.05）。因此水貂PIT-1 基因的C43T 和A143G 突变位点的合并基因型分析发现AADD 基因型个体和BBDD 基因型个体为优势基因型，可作为水貂体重、胸围、屠宰体重和体长性状的遗传标记。上述研究采用限制性片段长度多态分析技术（RFLP），该技术是第一代 DNA 标记。RFLP作为遗传标记具有其独特性：①共显性的标识；②结果不受环境因素影响；③非等位基因之间无基因互作效应。RFLP 分析技术在水貂育种中的应用将会加快该物种优良经济性状的选育进展。

2 小结与展望

分子遗传标记技术在水貂生长性状相关基因研究中发挥了重要的作用，大力推动了水貂育种的进程。相关基因包括生长轴相关基因GH-GHR-IGF-1-IGF-1R，在这些基因中应用的遗传标记技术主要有 AFLP、RFLP 和SNP 技术，其中单核苷酸多态性（SNP）具有明显优势，因为它们丰富，遗传稳定且适合高通量自动化分析。然而，由于缺乏水貂有关参考基因组侧翼标记序列的信息，这些标记的可用性仍然受到阻碍且成本较高。伴随组学技术的不断发展与创新，新一代分子遗传标记技术即简化基因组测序（genotyping-by-sequencing，GBS）应运而生，该技术主要利用二代测序（NGS）的优势来实现低成本和高通量基因分型，通过使用限制性内切酶（restriction endonuclease，RE）降低基因组的复杂性，然后生成NGS 序列标签[33]。通过选择对甲基化敏感的RE，可以避免基因组的重复区域，从而降低基因组的复杂性[34]。下一步应广泛应用GBS技术在动物中发现遗传标记，从而进行种群遗传学和基因组学研究，全面开发和研制功能性分子标记和特异基因芯片，使基础研究成果应用于实际育种生产中成为可能，为真正进入分子设计育种时代奠定基础。分子标记虽然为水貂育种开辟了一扇大门，但能否在育种实践中发挥应有的作用，还需要满足以下4 个方面：①是否能找到与目的基因性状紧密连锁的分子标记；②是否能绘制遗传标记多态性丰富的遗传图谱；③能否实现自动化分析分子标记，简化试验，大大降低成本；④是否能改进预测育种值的方法。当前，这4 个方面已经有所改进和完善，随着生物技术的飞速发展，分子标记将在水貂育种中占有重要地位。