中性粒细胞胞外诱捕网的形成机制及在肝病中的作用

曹 林，李 茜，纪龙珊，高月求,2，李 曼

1 上海市中医临床重点实验室 细胞免疫学实验室，上海 200120；2 上海中医药大学附属曙光医院 肝病科，上海 200120

中性粒细胞是外周血中最丰富的白细胞，在先天免疫系统中扮演着重要角色，是机体应对病原体入侵时的第一道防线[1]，除了通过胞吞作用吞噬病原微生物、释放嗜天青颗粒及产生并分泌颗粒状抗菌分子外，还具有抵抗微生物入侵的新机制—中性粒细胞细胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)的形成[2-3]。近年来的报道[4]表明，NETs可能在包括系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、糖尿病、血管炎等非传染性的疾病中发挥作用。本文主要阐述NETs的形成机制、结构组成及其在肝病中的最新研究进展。

1 NETs的形成机制

1996年，Takei等[5]用佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)刺激中性粒细胞时观察到其特殊的形态学变化，直至2004年Brinkmann等[6]经过验证并将其命名为NETs。NETs的形成不同于细胞的凋亡与坏死[7]，迄今为止，人们提出的NETs释放的机制包括：早期非溶解性NETs和晚期溶解性NETs[8]，两者是多种不同受体[Toll样受体(TLR)、Fc受体和补体受体等]通过识别无菌性和(或)感染性刺激导致中性粒细胞活化的结果。对前者而言，中性粒细胞通常被白色念珠菌、金黄色葡萄球菌等激活后的5～60 min即可释放NETs，这一过程不依赖于还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶复合物产生的活性氧(ROS)[9]，主要表现为：当TLR或某些菌株存在时，直接刺激血小板通过淋巴细胞关联抗原1与中性粒细胞结合，引起肽基精氨酸脱氨酶(peptidylarginine deiminase，PAD)4的活化，促进染色体解聚及中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)易位入胞核，随后经蛋白修饰的染色质通过核膜泡化和囊泡排出胞外，形成NETs，胞膜保持完整，细胞仍保持原有活力[8]。在晚期溶解性NETs中，胆固醇、PMA、IL-8、内毒素、Fc受体[10]和A类清道夫受体[11]等作用于中性粒细胞后的1～4 h即可形成NETs，在此过程中，内质网中的Ca2+进入胞质，使得RAF-MEK-MAPK通路或蛋白激酶C 被活化，导致NADPH氧化酶复合物产生ROS及激活PAD4，加速组蛋白的高聚亚氨酸化，促进染色质去浓缩。髓过氧化酶(myeloperoxidase，MPO)是NADPH氧化酶下游的一种酶，随之储存在中性粒细胞颗粒中的MPO和NE，转移到细胞核，促进染色质进一步展开，核膜解体，核内容物与胞质中的颗粒蛋白混合，胞膜破裂，以DNA为基础的混合物溢出到细胞外，最终细胞死亡，释放NETs[12-13]。

2 NETs的结构组成

NETs是一个以DNA为骨架的纤维网状结构，上面装饰着各种各样的直径为25～50 nm不等的球形蛋白结构域[13-14]。目前，蛋白质组学分析已检测到NETs中有多达80种蛋白质，其中，纤维网状结构是NETs发挥主要功能的物质，包括去浓缩的染色质和组蛋白，组蛋白约占所有与NETs连接的蛋白的70%，后者除了包含MPO、NE外，还含有如组织蛋白酶G、防御素、杀菌/通透性增强性蛋白[15]、乳铁蛋白、脂质运载蛋白2[16]、溶菌酶、抗菌肽、胶原酶等来源于中性粒细胞不同细胞器的蛋白,以及蛋白酶3、类胰蛋白酶、抗菌肽LL-37[17]等胞浆蛋白[1,18]。

3 NETs在肝病中的研究进展

3.1 无菌性炎症肝脏疾病 非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是一种伴随有炎症及肝细胞损伤的脂肪肝疾病，是发展成肝癌的危险因素。研究[19]发现NASH患者血清中NETs标志物(MPO-DNA)的表达升高；经DNase治疗或敲除PAD4基因的STAM模型(又称NASH-HCC模型)小鼠，发现NETs的形成减少，不影响肝内脂肪变性和游离脂肪酸的积累，但可防止巨噬细胞浸润，并将炎症环境改变为不利于肝癌生长的环境，肿瘤生长得到抑制，从而降低NASH向肝癌发展的风险。

肝缺血再灌注损伤(hepatic ischemia and reperfusion injury，IRI)是肝外科疾病中常见的病理过程。肝脏恢复血液供应后招募大量中性粒细胞浸润，受损的肝细胞释放高迁移率族蛋白1和组蛋白等损伤相关的分子模式识别受体通过TLR4/9信号通路介导中性粒细胞产生NETs，进一步增加肝细胞死亡，NETs还可以诱导Kupffer细胞释放IL-6、TNFα和CXCL-10等炎症因子和趋化因子以促进疾病的发展，加重损伤[20]。动物实验发现，小鼠缺血再灌注的损伤后，受损肝脏中的NETs表达升高，Sergio的团队[21]在肝脏特异性甲状腺素结合球蛋白的驱动下，构建了重组腺病毒8型载体(AAV8)，用于编码小鼠体内的基质金属蛋白酶-1的组织抑制剂(TIMP-1)，发现经rAAV8-TIMP-1载体处理的C57BL/6小鼠肝脏中TIMP-1选择性过表达，过表达的TIMP-1会抑制NETs的形成，对肝IRI有保护作用；Suyavaran的团队[22]发现，分别应用NADPH氧化酶2(NOX2)和p38 MAPK信号通路的抑制剂罗布麻苷和柚皮苷提前干预，可见NETs的释放、炎症因子及p38 MAPK的活化受到明显的抑制，提示NOX2、p38MAPK信号通路的抑制剂及TIMP-1在将来可能作为改善IRI患者的有效治疗药物。

3.2 慢性乙型肝炎(CHB)、肝硬化 CHB是HBV感染后，以炎性细胞浸润为主的病程漫长的、病情迁延反复、难以治愈的一种慢性病变[23]。HBV会影响中性粒细胞的功能而抑制NETs的释放。Hu等[24]在体外应用重组HBc蛋白和HBe蛋白干预，证实其可增强mTOR的活性，降低中性粒细胞的自噬作用及抑制ERK和p38 MAPK的依赖ROS的激活，减少NETs的释放，以逃脱被捕获和杀灭。满姗姗[25]纳入CHB患者和健康人各50例，发现CHB患者NETs的释放能力显著低于健康人，且HBsAg、HBeAg和抗-HBc的水平与NETs的释放呈负相关，猜测HBV可能对NETs的释放起抑制作用。HBeAg是一种分泌性非结构蛋白，HBV能够抑制NLRP3炎症小体的活化和IL-1β的成熟，主要是HBeAg抑制NF-κB信号通路和ROS的产生[26]，Leu等[27]应用重组HBeAg(rHBe)研究发现，rHBe抑制了单核细胞和中性粒细胞的迁移，在PMA刺激中性粒细胞后，rHBe降低了两种细胞的呼吸爆发，减弱了中性粒细胞释放NETs的能力。

肝硬化是一种慢性的、进行性的、破坏性的肝脏损害，同时伴有结缔组织的修复活动和收缩的综合征[28]。前期报道[29]指出，肝硬化患者的中性粒细胞在产生ROS方面存在缺陷，主要体现在超氧阴离子和过氧化氢的生成，这可能是导致肝硬化患者NETs释放能力不足的原因。自发性细菌性腹膜炎(spontaneous bacterial peritonitis,SBP)是肝硬化患者的一个重要并发症，主要是由于腹腔和腹水的突然感染引起。临床研究[30]发现，与健康受试者相比，患有SBP的肝硬化患者外周血和腹水中的中性粒细胞释放NETs的能力有所降低，主要是由于SBP患者的NADPH氧化酶功能缺失，最终影响ROS的产生，NETs释放能力受损，这种损伤与肝硬化失代偿程度成正比[31]。

3.3 肝癌 Seo等[32]临床研究结果显示，接触系统的激活和NETs的形成与肝病的严重程度密切相关，与健康者相比，肝细胞癌(HCC)患者NETs形成的标志物(DNA-组蛋白复合物、双链DNA、NE)和接触系统的标志物(Ⅻa因子、高分子激肽原)的表达显著升高，且门静脉血栓形成的HCC患者明显高于无门静脉血栓形成的患者，提示NETs和接触系统的标志物可作为HCC患者血栓形成的危险因素。体外研究[33]表明，NETs参与了手术应激后向肝转移的发展，可触发癌细胞释放高迁移率族蛋白B1，激活TLR9信号通路，促进癌细胞黏附、增殖、迁移和侵袭，可作为降低肿瘤复发的因素。

von Meijenfeldt的团队[34]发现，在整个肝移植过程中，与健康对照组相比，肝移植患者血浆中游离DNA、核小体和NETs标志物的水平较高，围手术期时，高表达的游离DNA和核小体参与肝移植过程中复杂的止血平衡，说明游离DNA和NETs可能通过激活凝血作用促进肝移植过程中的止血再平衡。

4 小结

NETs是细胞外DNA的网状结构，与抗菌分子有关，已被确定为脊椎动物先天免疫防御的一个重要组成部分[35]。我国是CHB的高发病率国家[36-37]，现代医学认为，CHB与机体免疫功能低下有关，HBV感染后会经历从免疫耐受期到免疫清除期，再到非活动期和可能的再活动期4个过程[38]，虽然已发现HBV能够抑制NETs的释放，但具体的作用过程及相关的信号转导有待完善。另外，研究[39]指出，NETs可直接杀死癌细胞或刺激免疫系统而具有抗癌特性，又可能促进癌细胞的迁移和免疫逃逸，或构成癌细胞与免疫功能细胞之间的物理屏障而具有促癌作用，NETs在肝癌中作用分子机制报道较少，还需要深入探讨。有证据表明中性粒细胞及其细胞内成分在自身免疫性肝病中发挥作用，但NETs作为一种激发机制参与自身免疫性肝病尚未得到详细研究[8]。

随着社会的进步，工作压力、饮食结构及生活习惯等引起的酒精性或非酒精性肝病在我国的患病率迅速升高[40]，对其研究也日益成为焦点。研究指出，急性饮酒会促进中性粒细胞浸润且加重慢性饮酒引起的肝损伤[41]，因此有必要关注NETs在酒精性或非酒精性肝病中的研究。NETs作为肝病领域中新的研究点，探讨其作用机理，细化其作用靶点，势必为肝病的治疗干预提供新方向。