鹿科动物染色体研究进展

唐丽昕，张然然，董世武，邢秀梅

（中国农业科学院特产研究所特种经济动物分子生物学重点实验室，吉林 长春 130112）

我国鹿类资源丰富，共有21 种，占全球的41.7%[1]。其中，鹿科动物属于哺乳纲偶蹄目，因其是名贵的药用动物而具有很高的研究价值。

染色体是细胞核内主要遗传物质的载体，它可以储存和运输DNA。染色体的变异包括染色体数目和结构的变异。染色体数目变异，指染色体整倍性和非整倍性变异。染色体结构变异则包括染色体片段的重复、缺失、倒位以及易位[2]。而染色体任何数目和结构上的变化都可能引起物种遗传变异的发生。染色体的这种变异也是生物多样性的主要来源之一。染色体研究无论对于了解物种的进化起源问题，还是研究新物种的形成，都有重要的意义[3]。对染色体的研究方法包括核型、带型分析以及结合微阵列分析[4]，荧光原位杂交[5]技术等。而鹿科动物已有的染色体研究普遍是核型和带型的。本文拟对近些年来鹿科动物染色体的相关研究方法以及研究进展进行概述。

1 鹿科动物染色体核型研究

核型又称染色体组型，是染色体形态学上的概念，指染色体的形态特征、大小及数目的总和。每种生物都有其特定的一套染色体核型。一般情况下，一个体细胞的染色体核型就可以代表个体的染色体特征。对物种染色体核型的观察可以得到染色体的基本形态学特征。同时，通过对物种间染色体核型的观察与比较，可以观察出物种在染色体核型上的特异性[6]。染色体核型的研究为进一步的分子细胞生物学研究奠定了基础。

鹿科动物的进化起源问题一直都存在着一些争议，尤其是梅花鹿和马鹿之间进化起源的先后问题。针对这一问题，仅从物种性状特征的进化以及地理分布变化方面进行研究是远远不够的。染色体核型的研究对于解决物种分类及进化起源问题是十分有必要的。一方面，可以从染色体数目和结构发生的差异来探寻鹿科动物染色体发生变异的主要机制；另一方面，可以从细胞遗传学角度为鹿科动物的分类及进化起源问题的后续研究提供一定的理论依据和参考。

在国外，很早就有学者对一些鹿科动物的染色体核型做过相关研究。自20 世纪60 年代开始，国内外就有鹿科动物染色体相关的研究报道。1963 年，Benirschke等[7]报道了弗吉尼亚白尾鹿的二倍体染色体数目为70。Gustavsson 等[8]报道了5 种鹿科动物的二倍体染色体数目，驼鹿（Alces alces）为 68，狍（Capreolus capreolus）为 70，马鹿（Cervus elaphus）为 68，梅花鹿（Cervus nippon）为 67，黇鹿（Dama dama）为 68。

1.1 梅花鹿染色体核型研究

梅花鹿是国家一级保护动物，已被列入《中国濒危动物红皮书》，很多学者都对其染色体的核型进行了研究。国外学者Gustavsson 等[9-10]报道了东北梅花鹿染色体数2n=64，68；日本梅花鹿染色体数目2n=66，67。而国内俞秀璋等[11]、王宗仁等[12]均通过试验得出东北梅花鹿染色体存在多态性2n=64 68。王宗仁等[13-14]报道，日本梅花鹿染色体数目的多态性2n=66 68。同时，通过将东北梅花鹿、东北马鹿和中亚马鹿的染色体核型作比较分析得出，虽然中亚马鹿是马鹿的一个亚种，但其与东北马鹿的染色体数目有差异，而与东北梅花鹿的相似，很可能是因为中亚马鹿较其他马鹿在进化上起源较早、比较接近于梅花鹿。祁得林[15]对青海地区梅花鹿染色体核型的研究证明，梅花鹿的染色体数2n=64 66，68，存在多态现象。梅花鹿染色体的多态现象，不仅存在于亚种之间，还存在于同一亚种的不同个体间，而这种多态现象可能与不同类型染色体数目的差异有关。

1.2 马鹿染色体核型研究

马鹿是大型鹿科动物，因其体型大、产茸量高而具有较大的研究价值。我国马鹿主要分布在西北，新疆地区，东北地区也有分布。王宗仁等[12,14]分别研究了中亚马鹿和东北马鹿的染色体核型，中亚马鹿的染色体数目为2n=66、67，存在多态现象，而东北马鹿染色体数目2n=68，并不存在多态现象。王宗仁等[13]也得出青鹿、东北马鹿染色体数目为2n=68，青鹿和东北马鹿的染色体组型一致，这就为将这2 个马鹿亚种并为1 个亚种提供了依据。另外，李军祥等[16]对青海地区的马鹿染色体核型进行了分析，得出染色体数2n=68。马鹿染色体存在多态性可能是因为减数分裂过程中配子随机结合。

1.3 驼鹿染色体核型研究

国外对驼鹿的研究比较早，Aula 等[17]在1964 年首次对欧洲驼鹿（A.a.alces）进行了核型研究，得到欧洲驼鹿染色体数是2n=68。随后，Hsu等[18]对西氏驼鹿（A.a.shirasi）和北美东部驼鹿（A.a.americana）进行了核型研究，得到这2 个亚种的染色体数是2n=70。而国内，卜令浩[19]对远东驼鹿的染色体核型进行了观察，其染色体数目是2n=68。将这3 个驼鹿亚种染色体核型的研究结果进行综合分析，得出远东马鹿与欧洲马鹿因核型相似而在亲缘关系上也更近。

1.4 其他鹿科动物染色体核型研究

还有一些其他鹿科动物的染色体核型研究，Miyake等[20]对虾夷鹿染色体核型研究发现，其核型不存在多态性。段幸生等[21]研究结果表明，黑麂的染色体数目（雄）2n=9，（雌）2n=8。毛冠鹿是分布在我国南方地区的珍稀鹿种。1983 年，张锡然等[22]首次报道了毛冠鹿的雌性核型（2n=47）和雄性核型（2n=48）。随后，王宗仁等[23]发现毛冠鹿染色体众数是2n=46。孔亚慧等[24]则发现毛冠鹿核型存在多态现象，证明了毛冠鹿有4 种核型。粘伟红等[25]首次发现在毛冠鹿染色体中存在2 条异型的X染色体。王宗仁等[14]将爪哇鹿与云南黑鹿的染色体核型进行比较，发现其染色体的核型、带型都很相似，确定了爪哇鹿和黑鹿是亲缘关系非常近的一个种。

1.5 杂交鹿染色体核型的研究

除了对纯种鹿染色体核型的研究外，还有一些对杂交鹿染色体核型的相关研究。方元等[27]研究并报道了云南水鹿和东北梅花鹿杂交鹿（F1）的染色体组型。杂交鹿（F1）的染色体数为2n=64。俞秀璋等[28-29]对赤鹿和梅花鹿的杂交后代进行了核型分析，初步表明其染色体数雌雄均为2n=67，此外，还对东北梅花鹿和东北马鹿的杂交后代进行了核型研究，发现杂交后代染色体数目为2n=66 68，而且染色体数目为2n=67 的杂交鹿是可育的核型。

1.6 鹿科动物染色体核型进化机制

王宗仁[26]通过将自已与前人的研究结合起来对鹿科动物染色体核型进行比较归纳，总结得出染色体变异的机制：鹿科动物染色体的变异主要是常染色体数目的变化。引起染色体数目发生变化的机制主要是罗伯逊断裂（即1 条中心着丝粒染色体断裂，形成2 条端着丝粒染色体）。

2 鹿科动物染色体显带技术

对于鹿科动物染色体的研究，常规的核型研究一直是不可忽视的。但是，随着鹿科动物染色体研究的不断深入，越来越多的学者尝试着将一些相对成熟的哺乳动物染色体研究技术应用于鹿科动物染色体的研究中，其中就包括染色体显带技术。染色体显带技术使染色体的研究更加深入，其不仅可以显示种内的染色体分化，而且能揭示许多核型研究不能显示的种间差异[30]。染色体的带型主要包括 G 带、C 带、Q 带、R 带以及银染Ag-NORs（N带）等。而对鹿科动物染色体带型的分析，G 带、C 带、R 带以及银染 Ag-NORs 的研究效果比较理想。Q带在鹿科动物染色体研究的文章并不多见。染色体显带技术及对其带型的分析成为研究鹿科动物细胞遗传学的又一重要方法。

2.1 G带

G带分析是染色体显带分析中应用最广泛的显带技术。将制备好的染色体标本用碱、胰蛋白酶或其他盐溶液处理后，再使用Giemsa 染液染色，在普通显微镜下，可见深浅相间的带纹，称G 带（G band）。在G 带分析中，每条染色体均有其特定的带型特征，G带暗纹区富含A-T 碱基对，亮带区则富含G-C 碱基对，深浅条纹交替排列在染色体上[31]。通过对于G 带的分析，可以得出染色体具体的类型、数目，以及相关的带纹特征信息。俞秀璋等[32]通过对东北梅花鹿G带的观察得出结论：确认东北梅花鹿染色体数2n=66，个体间染色体数不存在多态现象，但在同一个体内细胞染色体数有差异。王宗仁等[33]对白唇鹿的染色体G 带观察发现，白唇鹿在染色体数目及形态上都和东北梅花鹿十分相似且染色体类型相同。

2.2 C带

C 带是组成异染色质带的简称。C 带是用碱性溶液〔饱和Ba（OH）2溶液〕处理制片标本，再使用Giemsa染液染色得到的带型。染色体的C 带分析多用于染色体的多态分析，显示的是染色体全部的结构异染色质区域、次缢痕位置以及 Y 染色体。深染色的区域是DNA重复序列。这种显带方法特别适合于染色体的着丝粒区和Y染色体长臂的观察。段幸生等[21]通过对黑麂 C 带的研究发现其染色体着丝点区特别长且异染色质非常丰富，但异染色质的短臂长短有异，存在多态现象。粘伟红等[25]对毛冠鹿C 带进行研究，发现毛冠鹿异染色质的分布和含量存在差异会导致染色体产生多态现象：常染色体上异染色质分布不均匀使得同源染色体产生差别，而在性染色体上因为异染色质含量不同，染色体大小产生明显差别。

2.3 R带

R 带是G 带的反带，在G 带呈深带的区域，R 带呈现的就是浅带。R带是用热盐处理制片标本，再使用Giemsa 染液染色，得到与G 带带型相反的带纹。R 带的显带技术主要用来研究染色体末端发生的异常，如缺失和重排。而鹿科动物方面，蒋德梅[34]通过试验得到东北梅花鹿R 带模式图，并将其与已有的鹿科动物的染色体R 带进行比较，发现了在染色体的压缩层面上，同一物种的相似性和稳定性以及同一物种不同亚种间的差异性。

2.4 N带

N 带又称银染Ag-NORs 显带，是在高温条件下，用三氯醋酸处理制片标本，再在温育后用Giemsa染液染色得到的核仁组织区深染，其他部分浅染的带型。N带显带技术主要用来对结构上的非组蛋白的蛋白质和核仁组织区特异性结合的地方进行识别和分析。Ag-NORs 是随染色体而遗传的，可作为品种特征的遗传标记之一，用于研究品种间的差异，以探讨品种的起源进化。在家猪[35-36]上已有报道Ag-NORs，不但有品种和个体差异，而且与猪的起源进化有关。而鹿科动物中，韩莉[37]观察发现Ag-NORs 主要位于染色体的着丝粒位置，说明东北梅花鹿的异染色质主要以着丝粒带的形式出现，通过与C 带比较，说明东北梅花鹿染色体在亚种水平上可能存在异染色质多态性。

2.5 其他

另外，还有一些其他的研究，例如染色体的高分辨显带，限制性内切酶显带等。高分辨染色体，是指通过某种处理，获得有丝分裂早期染色体的分裂相，显带后可得到更多更细的带纹，从而提高了人类对染色体的分辨力[38]。赵婉婷等[39]通过试验得出单套染色体共显带456 条，并以此为基础，绘制了梅花鹿高分辨G 带模式图。而限制性内切酶显带技术因其可对原位固定的染色体诱导显带，并可从光镜和电镜多个角度对染色体结构进行分析，被广泛应用于真核生物中。蒋德梅等[40]采用限制性内切酶Hae Ⅲ和Hind Ⅲ分别处理东北梅花鹿中期染色体标本，得到了类似G 带和C 带，同时得出了12 对常染色体和1 对性染色体具有异质性。

3 荧光原位杂交技术在动物染色体研究中的应用

荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）技术可以鉴别特异性序列，染色体亚区，或整个基因组；可以特别地突出中期或间期细胞的形态和数目。该技术可用于识别染色体，检测染色体异常或确定特定序列的染色体位置。FISH 在细胞遗传学、产前诊断、肿瘤生物学、基因扩增和基因定位等诸多研究领域发挥着越来越重要的作用[41]。其原理是将特定的DNA探针用荧光素进行标记，再将标记后的探针与靶DNA进行原位杂交，经荧光检测体系在镜下对靶DNA 进行定性、定量或相对定位分析[42]。染色体异常包括染色体数目和结构的异常，而大部分数目的异常都会导致疾病的发生。单单采用染色体显带分析并不能解决所有的染色体异常问题，而采用荧光原位杂交技术能很好地解决[43]。丁银润[44]采用荧光原位杂交技术直接检测出昆明山海棠水抽提物（THH）在哺乳动物细胞中作用产生的非整倍体。Bonnet-Garnier A[45]利用荧光原位杂交（FISH）技术，采用牛和山羊的BAC 探针，验证了13 个通过普通的R 带显带分析得不出的罗伯逊易位。

4 小结与展望

染色体的研究在对了解生物的遗传变异、系统演化、性别决定、个体发育和生理过程的平衡和控制等方面都有重要作用，染色体分析已经是细胞遗传学必不可少的重要环节[25]。

鹿科动物种类繁多，且经济价值较高。对于鹿科动物染色体，最集中的研究时间是20 世纪80～90 年代，主要是在细胞水平上的研究，借助显微镜来观察各鹿科动物及其杂交后代的染色体核型及其不同种类的显带分析。细胞遗传学的核型和显带分析已经研究得十分深入。随着分子生物学技术的发展，针对染色体的研究从细胞遗传学深入到分子细胞遗传学。我们对于鹿科动物染色体的研究不能仅仅局限于细胞水平上核型以及显带分析，应该在此基础上拓展新的、更具意义的研究领域。可以把基本的染色体核型研究与现代先进的生物技术以及生物信息学相结合，将染色体进行深度剖析，逐步获得基因在染色体上的定位，一方面，将不同鹿科动物同一位置染色体上的序列进行比对，从而解释鹿科动物中不同物种，甚至亚种间的差异。另一方面，将细胞遗传学研究转向基因组学研究，从基因组学的水平上研究鹿科动物染色体与基因以及基因对应的生物重要性状的关系，将鹿科动物染色体的研究带入到一个全新的基因组学时代。